竇涪琳，劉慶珍，徐巧瑩，劉海英，傅余芹

山東大學第二醫(yī)院，濟南 250021

膜性腎?。∕N）是成人腎病綜合征最常見的病理類型，其病理特征為彌漫性腎小球基底膜增厚伴上皮下免疫復合物沉積。MN是由自身免疫反應引起的腎小球損害。自身抗體與足細胞靶向結(jié)合引起了免疫復合物沉積、腎小球基底膜增厚以及足細胞形態(tài)改變，從而導致蛋白尿的進展［1］。近年來在MN中發(fā)現(xiàn)了多種自身抗原，包括分泌型磷脂酶A2受體（PLA2R1）［2］、含7A的血栓反應蛋白1型結(jié)構(gòu)域（THSD7A）［3］和神經(jīng)表皮生長因子樣1蛋白（NELL-1）［4］，分別占MN患者的70%～80%、3%～5%及5%～10%。外周循環(huán)抗體的測定已成為臨床重要的參考指標。體內(nèi)外實驗證據(jù)表明多種通路和細胞因子在MN的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用。然而，MN的分子機制尚不完全清楚。生物信息學分析允許在基因組水平上進行基因改變的篩選。然而，獨立的微陣列分析常導致假陽性率。本研究從基因表達公共數(shù)據(jù)庫（GEO）中獲得MN患者的兩個微陣列數(shù)據(jù)集（GSE108109、GSE115857），將原始數(shù)據(jù)進行一系列處理后，識別MN相關(guān)的Hub基因，應用NephonSeq v5平臺分析Hub基因與MN臨床特征的相關(guān)性，以便進一步探討MN的發(fā)病機制以及涉及的關(guān)鍵基因。

1 材料與方法

1.1 微陣列數(shù)據(jù)搜索和下載 本研究中的微陣列數(shù)據(jù)從基因表達數(shù)據(jù)庫（GEO）下載（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）。搜索的關(guān)鍵詞為“膜性腎病”，且符合以下標準：研究類型為表達譜基因芯片；組織來源為人類腎組織?；谏鲜鰳藴?，選擇了GSE108109、GSE115857這兩個數(shù)據(jù)集。GSE108109基于GPL19983，包括MN組44例，正常對照組6例；GSE115857基于GPL14951，包括MN組11例，正常對照組7例。

1.2 差異表達基因（DEGs）識別 用GEO2R網(wǎng)絡工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r）分別對GSE108109、GSE115857進行分析，得到MN組與正常對照組的差異基因ID，其中篩選條件為|log2FC（差異倍數(shù)）|＞1且校正后的P值（adj.P）＜0.05。利用平臺信息文件將表達譜芯片中的探針矩陣轉(zhuǎn)化為基因矩陣。若沒有相應的基因符號就剔除，若有多個基因探針組，則在探針組中取中位數(shù)。隨后，將上述兩組差異基因上傳到Venn圖中，重疊基因即為本研究中的DEGs。

1.3 DEGs的基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析 將DEGs上傳到DAVID在線數(shù)據(jù)分析工具，進行GO富集和KEGG富集分析，其中P＜0.05表明在統(tǒng)計學上差異有統(tǒng)計學意義（6.8版，http：//david.ncifcrf.gov）。

1.4 蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡構(gòu)建與Hub基因識別 用STRING工具（10.0版本，http：//string-db.org）構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡，探索DEGs與互作網(wǎng)絡之間的聯(lián)系。其中綜合得分閾值＞0.4表明在統(tǒng)計學上有顯著的相互作用。用Cytoscape軟件（6.3版，http：//www.cytoscape.org/）來進一步分析和可視化PPI網(wǎng)絡數(shù)據(jù)。應用CytoHubba中的“Degree”分析方法，從所有DEGs中發(fā)現(xiàn)特征節(jié)點并識別Hub基因，其中Degree≥7的基因為Hub基因。

1.5 Hub基因分析 應用NephonSeq v5在線平臺（http：//v5.nephroseq.org），對MN患者Hub基因的表達與血肌酐、蛋白尿之間進行皮爾遜相關(guān)性分析，|r|＞0.5表示兩者有相關(guān)性，|r|值越大表示相關(guān)性越好，正數(shù)代表正相關(guān)，負數(shù)代表負相關(guān)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MN中的DEGs GSE108109、GSE115857中分別有1 478和4 345個差異基因，有240個DEGs，DEGs中分別有149個上調(diào)基因和91個下調(diào)基因（圖1）。

2.2 MN中DEGs的GO與KEGG分析結(jié)果 MN中DEGs的GO分析結(jié)果顯示，其生物學過程（BP）顯著富集在細胞形態(tài)調(diào)節(jié)、肌動蛋白細胞骨架組織的調(diào)節(jié)、脂蛋白代謝及B細胞穩(wěn)態(tài)等過程，其細胞成分（CC）顯著富集在質(zhì)膜、基底膜、細胞間橋等，其分子功能（MF）顯著富集在氧化還原酶活性、蛋白激酶C及細胞周期蛋白結(jié)合等；KEGG分析顯示，DEGs顯著富集在p53信號通路、脂肪細胞脂解的調(diào)節(jié)及凋亡等。見圖2。

2.3 DEGs的PPI網(wǎng)絡及Hub基因 DEGs的PPI網(wǎng)絡（圖1）平均節(jié)點連通度為3.11，平均局部聚類系數(shù)為0.156，蛋白相互連接數(shù)為224。Hub基因包括TP53、PIK3R1、KIT、QSOX1、LAMB1、SHC1、CDK2、APOL1、NES、PTPN6、POLR2A、PRKACA、LTBP1基因。在PPI網(wǎng)絡中，Hub基因與其他基因聯(lián)系緊密（圖3）。13個Hub基因中，10個基因表達上調(diào)，包括TP53、QSOX1、SHC1、CDK2、APOL1、NES、PTPN6、POLR2A、PRKACA、LTBP1，3個基因表達下調(diào)，包括LAMB1、PIK3R1、KIT。

注：橢圓形節(jié)點代表上調(diào)基因，菱形節(jié)點代表下調(diào)基因。

圖2 MN中DEGs的GO和KEGG富集分析

2.4 Hub基因與MN臨床特征的關(guān)系 MN患者腎組織中，PRKACA、LTBP1基因表達與蛋白尿呈正相關(guān)（r分別為0.858、0.799，P分別為0.006、0.017），POLR2A的表達與蛋白尿呈負相關(guān)（r=-0.866，P=0.005）。另外，PRKACA基因表達與血肌酐呈負相關(guān)（r=-0.601，P=0.008），POLR2A的表達與血肌酐呈正相關(guān)（r=0.583，P=0.011）。

圖3 Hub基因的PPI網(wǎng)絡

3 討論

MN是導致亞洲成年人腎病綜合征的最常見原因之一，約占30%。MN患者的臨床病程差異懸殊，約40%的患者會自發(fā)緩解，而30%的患者對免疫抑制治療效果不佳，最終進展至終末期腎病［5］。因此對MN的免疫抑制治療開始時機及治療力度一直存在很大的爭議，MN患者的精準化治療也由此應運而生，而治療的關(guān)鍵是識別疾病的確切病因及發(fā)病機制。在不到十年的時間里，MN分子病理機制的研究發(fā)展迅速，有些已廣泛應用于臨床，但目前仍有很多潛在未知的機制存在。本研究應用生物信息學方法探討MN的分子機制，并試圖尋找潛在的新治療靶點。共篩選出240個差異基因，它們參與細胞形態(tài)調(diào)節(jié)、細胞骨架構(gòu)建等生物學功能。其中13個基因被認定是Hub基因，包括TP53、PIK3R1、KIT、QSOX1、LAMB1、SHC1、CDK2、APOL1、NES、PTPN6、POLR2A、PRKACA、LTBP1。

TP53/P53，參與細胞周期與細胞凋亡的調(diào)節(jié)，與多種人類腫瘤有關(guān)，其中包括腎透明細胞癌。曾有研究報道，iNOS和P53在IgAN固有腎細胞中表達上調(diào)，可能共同誘導細胞凋亡活性，從而介導IgA腎病進行性腎損傷［6］。微陣列分析表明TP53編碼的蛋白與腎功能衰竭的進展有關(guān)［7］。LTBP1基因編碼的蛋白，屬于潛在轉(zhuǎn)化生長因子-β結(jié)合蛋白家族（LTBPs），它是TGF-β分泌與激活的調(diào)節(jié)蛋白之一。HUANG等［8］發(fā)現(xiàn)LTBP-1可能通過調(diào)節(jié)TGF-β活性參與糖尿病腎病的發(fā)病過程。LEE等［9］報道，MN患者足細胞中TGF-β的表達上調(diào)。TGF-β通過多個方面導致慢性腎臟病的腎纖維化過程，包括近端腎小管功能障礙、上皮細胞修復和再分化失敗，以及隨之而來的腎小管間質(zhì)纖維化［10］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，TP53是TGF-β誘導的信號通路中的一個輔助因子，并且是幾種TGF-β促纖維化反應基因的轉(zhuǎn)錄輔助調(diào)節(jié)因子，以TP53為靶點的藥理學和遺傳學方法減弱了相關(guān)基因的表達，減輕了腎纖維化反應，證實了TP53在腎臟疾病中的關(guān)鍵作用［11］。結(jié)果顯示，在MN患者的腎臟組織中，LTBP1與蛋白尿呈正相關(guān)，提示LTBP1參與MN患者腎損傷的進展，可能與激活TGF-β有關(guān)，并且協(xié)同TP53參與了TGF-β1誘導的腎損傷過程。CDK2編碼的蛋白參與細胞周期調(diào)控，微陣列分析表明CDK2編碼的蛋白與腎功能衰竭的進展有關(guān)［7］。抑制新月體腎炎小鼠的CDK2活性，可抑制足細胞增殖從而改善腎功能［12］，提示抑制CDK2活性是治療以足細胞增殖為特征的腎小球疾病的潛在靶點。而SAURUS等［13］發(fā)現(xiàn)，阻止CDK2表達下調(diào)，可保護足細胞免于凋亡。提示CDK2基因的異常表達，無論是高表達還是低表達，均會對足細胞產(chǎn)生影響。

SHC1在多種組織中表達，包括腎細胞，參與調(diào)節(jié)細胞氧化應激的應答。MARTIN等［14］發(fā)現(xiàn)SHC1在蛋白尿性腎病中過度表達，SHC1的增加導致足細胞裂孔隔膜的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分變形和分解，破壞了濾過屏障的完整性。p66Shc是Shc1基因編碼的三種銜接蛋白之一，p66Shc作為一種氧化還原酶，導致氧減少、ROS產(chǎn)生增多，引起線粒體腫脹，并導致CytC釋放到胞質(zhì)中，迫使細胞沿凋亡途徑下行［15］。p66Shc與多種腎臟疾病的進展及惡化相關(guān)［16］，該基因在糖尿病腎病患者腎組織中表達上調(diào)，且被認為是腎小管氧化損傷的潛在生物標志物［17-18］。MILLER等［19］報道，p66Shc參與調(diào)節(jié)腎血管張力，在高血壓腎病大鼠中過度表達，促使高血壓腎病腎血管功能受損。此外，該基因還參與年齡相關(guān)性腎臟病變［20］、抗癌藥物腎毒性［16］的進展。據(jù)報道，APOL1高風險變異體（G1和G2）與非洲血統(tǒng)慢性腎臟病的高發(fā)病率相關(guān)，被認為是腎風險變異。由于足細胞有限的修復和再生能力，并且對自噬相對敏感，所以足細胞容易受到載脂蛋白1野生型（G0）和高風險變異體（G1和G2）的影響［21］。另外，APOL1基因也被全基因組關(guān)聯(lián)研究鑒定為足細胞病的易感基因之一［22］。另外，APOL1的表達可能會在腎臟積聚并導致炎癥加?。?2］。APOL1高風險變異體引起的腎臟病理表現(xiàn)有局灶節(jié)段性腎小球硬化、塌陷性腎小球疾病和伴有動脈腎硬化的非特異性局灶球性腎小球硬化，而且APOL1高風險變異體可影響多種疾病，如膜性腎病［23］、狼瘡性腎炎、糖尿病腎病的預后，此外，PLA2R抗體相關(guān)IMN患者中，APOL1高風險變異體的腎臟病理表現(xiàn)為塌陷性腎小球疾?。?3］。

PRKACA基因編碼的蛋白是參與細胞凋亡的蛋白激酶A亞單位之一。目前，PRKACA擴增是鑒定庫欣綜合征相關(guān)基因缺陷的一種方法。先前的研究通過微陣列分析觀察到，IgA腎病患者單核細胞會出現(xiàn)該基因的表達改變，可能通過調(diào)節(jié)IgAN進程中的凋亡來發(fā)揮其在單核細胞中的作用［24］。本結(jié)果顯示在MN患者中，PRKACA的表達與血肌酐呈負相關(guān)，與蛋白尿呈正相關(guān)，提示PRKACA基因的異常表達，均會對疾病進展產(chǎn)生影響。PTPN6是蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）家族的一員。PTPs被認為對損傷和再生反應具有多方面的調(diào)節(jié)作用。有多項研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠的PTPN6表達增加，通過引起VEGF抵抗，降低足細胞中neparin的磷酸化水平，從而導致足細胞凋亡［25］。而近期研究表明，腎缺血再灌注大鼠PTPN6基因敲除后，腎小管上皮細胞促凋亡信號被過度激活［26］。應用生物信息學方法檢測慢性腎小球腎炎大鼠PIK3R1基因的表達，發(fā)現(xiàn)該基因的表達明顯升高，可能是慢性腎小球腎炎發(fā)病的關(guān)鍵基因［27］。在一項薈萃分析中，PIK3R1被鑒定為有腎臟功能的基因［28］。

到目前為止，很少有研究提到KIT、QSOX1、NES、LAMB1和POLR2A與MN的相互作用關(guān)系。KIT，通常被稱為原癌基因c-kit，編碼一種酪氨酸激酶受體，可磷酸化多種細胞內(nèi)蛋白，這些蛋白在多種細胞類型的增殖、分化、遷移和凋亡中發(fā)揮作用。QSOX1在多種腫瘤疾病中過度表達，尤其是乳腺癌。NES，該基因主要在神經(jīng)細胞中表達，相關(guān)的疾病包括室管膜母細胞瘤和腦室周圍白質(zhì)軟化癥。LAMB1，是基底膜的主要非膠原成分，與多種生物學過程有關(guān)，包括細胞粘附、分化、遷移、信號傳導、突起生長和轉(zhuǎn)移等。在MN患者中，POLR2A的表達與血肌酐呈正相關(guān)，與蛋白尿呈負相關(guān)，推測POLR2A的異常表達與MN患者腎損傷的進展密切相關(guān)。

盡管本研究中部分潛在的Hub基因在既往MN的相關(guān)文獻中未被報道，但這些基因在足細胞損傷、腎纖維化等病理過程中的作用已被大量實驗證實，提示它們可能在MN的發(fā)生和發(fā)展中也起重要作用。然而，本研究存在一定的局限性。首先，來自GEO的臨床資料并不適用于每個樣本。此外，微陣列數(shù)據(jù)來自MN的不同階段，不同階段的某些基因表達水平可能不完全相同。最后，這些潛在候選基因的具體分子機制和生物學功能仍有待進一步實驗研究驗證。本研究通過生物信息學分析腎組織微陣列數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)240個DEGs和13個新的潛在的Hub基因，這些基因可能是MN潛在治療靶點的生物標記物。這為加深MN分子機制的理解提供了科學可靠的數(shù)據(jù)，為今后MN研究提供了寶貴資源。