吳蕊辛，鄭薇，李寧，芮忠穎，周雅倩，王萱

天津醫(yī)科大學總醫(yī)院，天津 300052

Graves病是自身免疫性甲狀腺病最常見的類型［1］。Graves眼病（GO）是Graves病最常見的甲狀腺外表現(xiàn)［2］，通常累及眼球后脂肪、眼外肌等，從而造成眼部炎癥、組織腫脹和纖維變性。目前研究認為，促甲狀腺素受體抗體（TRAb）在Graves病及GO的發(fā)病過程中起重要作用。近年有研究報道，GO患者眼眶成纖維細胞中胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）高表達，IGF-1R是GO的致病抗原之一［3-4］。胰島素樣生長因子1（IGF-1）通過與IGF-1R結合刺激GO患者眼眶成纖維細胞分泌透明質酸，與增多的脂肪細胞共同參與GO的發(fā)生發(fā)展，IGF-1R是GO患者眼眶成纖維細胞增殖的重要始動因素［5-6］。本課題組前期通過轉染促甲狀腺激素受體（TSHR）α亞單位重組質粒成功誘導出Graves病小鼠模型［7-8］，鑒于IGF-1R在GO發(fā)病過程中的重要作用，本研究擬構建IGF-1R重組真核表達質粒，為誘導Graves病伴GO動物模型奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 TRIzol試劑購自美國Gibco公司，RTPCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，限制性內切酶BamHⅠ、ScaⅠ、HindⅢ購自美國NEB公司，質粒提取試劑盒、DNA Marker、DNA純化試劑盒購自北京天為時代科技有限公司，E.coli TOP10和pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO購自美國Invitrogen公司，上下游引物合成及DNA測序由上海生工生物技術公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據美國國立生物技術信息中心（NCBI）公布的人IGF-1R基因編碼序列（NM_000875.5）和pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO質粒載體信息，設計擴增IGF-1Rα亞單位引物，并在上游引物5'-端增加CACC拓撲克隆位點，保證克隆方向正確性和提高克隆效率。上游引物序列：5'-CACCATGAAGTCTGGCTCCG-3'，下游引物序列：5'-TAGCTTGGCCCCTCCATACT-3'，擴增產物長度2 679 bp。

1.2.2 甲狀腺組織總RNA提取 收集來自天津醫(yī)科大學總醫(yī)院甲狀腺外科Graves病患者手術切除的新鮮甲狀腺組織，采用TRIzol一步法提取總RNA。取組織標本約50 mg，在放有液氮的研缽中研成粉末后移入加有1 mL試劑的冰浴的玻璃勻漿器中，冰浴下勻漿5 min。勻漿液移入1.5 mL離心管中，25℃水浴5 min，加入0.2 mL三氯甲烷劇烈振蕩15 s，25℃水浴3 min，4℃12 000 g離心15 min。吸取上層水相加等量異丙醇，混勻，25℃水浴10 min，4℃12 000 g離心15 min。棄上清，RNA沉淀中加入由DEPC處理的水配制的75%乙醇1 mL，旋轉混勻，4℃7 500 g離心5 min，棄去上清液。將RNA沉淀自然涼干，加入DEPC處理的水60μL，55℃溫浴10 min溶解RNA。利用紫外—可見光分光光度計測定RNA純度和濃度，1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。

1.2.3 逆轉錄合成甲狀腺cDNA 以500 ng總RNA為模板，用Oligo（dT）為引物，按照逆轉錄試劑盒說明制備cDNA。

1.2.4 IGF-1Rα亞單位基因PCR擴增 用Taq Platinum聚合酶擴增IGF-1Rα亞單位基因片段。PCR反應體系：上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，cDNA 1.5μL，2×MasterMix 12.5μL，去離子水9.0μL，總反應體積25μL。PCR反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性45 s，63℃退火1 min，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像儀上觀察分析擴增結果，切取含目的片段（2 679 bp）的凝膠，以DNA純化試劑盒回收純化目的片段用于與載體連接。

1.2.5 IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO真核表達質粒的構建 用新鮮的IGF-1Rα亞單位基因PCR回收產物與pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO載體（5 514 bp）進行拓撲克隆連接。將PCR回收產物1μL、TOPO vector 1μL、反應緩沖液1μL、超純水3μL輕柔混合，室溫（22～23℃）孵育30 min。取4μL混合物與E.coli One Shot?TOP10（50μL）感受態(tài)細胞混合，冰浴30 min。將混合物置于42℃的水浴中熱休克30 s，使混合物立即冷卻，加入250μL SOC培養(yǎng)基，放入空氣浴振蕩器，37℃200 r/min 30 min。取100μL反應物鋪于含氨芐青霉素100μg/mL的LB培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)過夜后觀察菌落生長情況。

1.2.6 IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO真核表達質粒的鑒定 次日從培養(yǎng)板中隨機挑取3個陽性單克隆菌落（命名為1號、6號、8號），分別接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，加入5μL 1 mg/mL的氨芐青霉素，混勻，37℃200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。按照質粒提取試劑盒說明書提取IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組質粒，以其為模板進行PCR擴增（反應條件同前）鑒定。用限制性內切酶HindⅢ或BamHⅠ分別消化重組質粒，IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組質粒0.5μL（1μg/μL），10×HindⅢ或BamHⅠ酶切緩沖液3μL，再加HindⅢ或BamHⅠ1μL（10 U/μL），以超純水補充體積至30μL，37℃消化2 h，產物行1%瓊脂糖凝膠電泳。先用限制性內切酶BamHⅠ消化IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組質粒，反應條件同前，行1%瓊脂糖凝膠電泳并回收酶切產物。再用ScaⅠ消化上述酶切產物，酶切產物5μL，10×ScaⅠ酶切緩沖液3μL，ScaⅠ1μL（10 U/μL），以超純水補充體積至30μL，37℃消化2 h，產物行1%瓊脂糖凝膠電泳。經PCR驗證和限制性內切酶酶切鑒定陽性的重組質粒分別以T7正向引物和BGH反向引物為測序引物進一步做測序分析，并與目的基因序列進行比對驗證。

2 結果

2.1 Graves病患者甲狀腺組織總RNA純度、完整性測定結果 Graves病患者甲狀腺組織中總RNA OD260/OD280為1.8～2.0，純度較好。1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA 28 s、18 s大小亞基結構完整，結果見圖1。

圖1 Graves病患者甲狀腺組織中總RNA 1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 IGF-1Rα亞單位基因PCR擴增結果 1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，PCR產物在約2 600 bp處可見一條清晰、特異的條帶，與目的基因片段長度2 679 bp基本吻合，見圖2。

2.3 IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組質粒的鑒定結果 含有IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組質粒的單克隆菌落見圖3。以該重組質粒為模板PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳顯示，在約2 600 bp處可見清晰、特異的目的條帶，初步證實重組質粒中含有IGF-1Rα亞單位目的基因（2 679 bp）片段，見圖4。

圖2 IGF-1Rα亞單位基因PCR產物電泳圖

圖3 轉化IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組質粒的大腸桿菌陽性菌落

圖4 IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組質粒PCR擴增產物電泳圖

重組質粒經單酶切（HindⅢ或BamHⅠ），分別產生約8 100 bp單一特異產物，與IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組質粒（8 193 bp）大小一致，見圖5。經雙酶切（BamHⅠ和ScaⅠ），產生約250 bp和7 900 bp兩條特異產物條帶，與預期結果265 bp和7 928 bp相符，見圖5。重組質粒酶切結果證明，篩選出的陽性菌落中含有IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組質粒。

圖5 IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組質粒酶切鑒定電泳圖

經比對，插入的目的片段序列與NCBI公布的人IGF-1Rα亞單位基因編碼序列（NM_000875.5）完全一致，接口序列與Invitrogen公司的pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO載體一致，讀碼框架正確。證明IGF-1Rα亞單位目的基因片段已成功插入表達載體，IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO真核重組表達質粒構建成功。

3 討論

GO是Graves病最常見的甲狀腺外表現(xiàn)，25%～50%的Graves病患者會發(fā)展為GO，其表現(xiàn)為因眶內結締組織和脂肪組織擴張而出現(xiàn)眼球突出等臨床癥狀［9］。GO的發(fā)病機制目前尚不明確，1986年人們首次在大鼠甲狀腺細胞中發(fā)現(xiàn)促甲狀腺激素（TSH）和IGF-1信號通路間存在聯(lián)系［10］。2008年TSUI等［11］通過比較GO患者和健康對照者眼眶成纖維細胞和甲狀腺細胞表面IGF-1R、TSHR水平，發(fā)現(xiàn)TSHR、IGF-1R之間存在物理和功能上的共定位現(xiàn)象，TSHR、IGF-1R在甲狀腺和眼眶組織中可能共同構成一個功能復合體。TSHR和IGF-1R是導致GO患者眼眶成纖維細胞增殖的重要因素［5-12］。

關于Graves病動物模型的研究已有30余年，但至今尚未制備出比較理想的Graves病伴GO的動物模型。2013年MOSHKELGOSHA等［13］用TSHRα亞單位基因重組腺病毒免疫小鼠產生TRAb而誘導出Graves病模型，部分模型小鼠出現(xiàn)眼眶腫脹充血、單側或雙側眼球突出，大部分小鼠眼外肌增粗，有些小鼠出現(xiàn)球后脂肪組織増多，球后肌纖維黏多糖沉積及CD3+T細胞、巨噬細胞和肥大細胞眶內浸潤，眼眶部位MRI成像顯示眼眶肌增粗和周圍脂肪增多等，但小鼠血清TRAb大部分為促甲狀腺素受體阻斷性抗體（TSBAb），甲狀腺組織病理學表現(xiàn)為甲狀腺功能減退。2017年XIA等［14］報道，在約30%Graves病小鼠中觀察到眼裂增寬、眼部MRI顯示眼外肌增大、眼外肌T淋巴細胞浸潤（約50%）及透明質酸聚集（約30%），但未見明顯眼球突出和球后脂肪增多。

隨著對GO發(fā)病機制認識的不斷深入，IGF-1R作為GO的重要致病抗原，逐漸成為GO發(fā)病機制的研究熱點分子［12］。IGF-1R是一種酪氨酸激酶受體家族跨膜受體，由2個α亞基和2個β亞基組成，α亞基（殘基1-707）完全位于胞外且與配體結合，是IGF-1R與IGF-1結合的主要部位，β亞基（殘基712-1337）是包括細胞內酪氨酸激酶結構域的跨膜結構［15-16］。配體IGF-1與IGF-1Rα亞基的結合會誘導受體的構象變化，導致β亞基的激酶催化C結構域中的三個酪氨酸殘基發(fā)生自磷酸化，活化下游信號傳導通路［17］，因此IGF-1Rα亞單位是IGF-1R發(fā)揮生物學功能的核心區(qū)域，在GO的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用。

本研究設計構建IGF-1Rα亞單位重組真核表達質粒用于誘導Graves病伴GO小鼠模型是基于以下兩點考慮：第一，IGF-1Rα亞單位在GO的發(fā)生發(fā)展中起著獨特作用，目前罕見應用IGF-1Rα亞單位基因誘導GO模型的成功報道；第二，相較于IGF-1R基因全長，α亞單位基因片段更小，有利于通過電穿孔將重組質粒轉染動物，轉染效率高，更易誘導出GO動物模型。根據人類蛋白質圖譜公布的人體各類組織中IGF-1R水平分布情況可知，性腺、小腦、胰腺、甲狀腺等組織中IGF-1R高表達，考慮組織獲得的難易程度和體積大小，最終選擇從甲狀腺外科切除術中獲得Graves病患者的新鮮甲狀腺組織，采用TRIzol一步法提取總RNA。根據NCBI公布的人IGF-1R基因編碼序列和pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO質粒載體信息設計了多對引物作為候選。自身配對較多的引物會導致PCR產生非特異性擴增，引物GC含量過高會導致擴增困難，因此本研究選定自身互補配對數小于5且GC含量小于60%的引物作為特異性的擴增引物，運用RT-PCR技術擴增出IGF-1Rα亞單位mRNA編碼序列，其長度為2 679 bp，編碼893個氨基酸。此外，引物設計時還考慮到載體5'-末端懸掛四個堿基GTGG，在上游引物加5'-端CACC，這樣既可以保證拓撲克隆方向正確，又可以提高連接效率（正確率大于90%），大大減少了后續(xù)重組質粒鑒定的工作量。

綜上所述，本研究成功構建了IGF-1Rα-pcDNA?3.1D/V5-His-TOPO重組真核表達質粒，為誘導Graves病伴GO動物模型研究奠定了基礎。