沈 艷，何鵬搏，何鵬飛，吳毅歆，孔寶華，李興玉，Shahzad Munir，何月秋

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，昆明 650201）

0 引言

番茄為茄科番茄屬一年生或多年生草本植物，是全球栽培最廣、消費量最大的蔬菜作物。中國是世界最大的番茄生產(chǎn)和消費國家，番茄生產(chǎn)是農(nóng)民增收致富和出口創(chuàng)匯的重要產(chǎn)業(yè)[1-2]。連年栽培導(dǎo)致番茄病害越來越嚴(yán)重[3]。其中，番茄灰霉病是北方地區(qū)番茄生產(chǎn)中常見、高發(fā)的病害之一，塑料大棚、溫室、露地栽培均嚴(yán)重發(fā)生的病害[4]。灰葡萄孢菌產(chǎn)孢量大、寄主范圍廣泛，可為害茄科、葫蘆科、薔薇科等470多種植物[5]，該菌不僅在作物生長期間，而且在采后儲藏、運輸過程中也會引起灰霉病嚴(yán)重發(fā)生[6]，給番茄的采后處理、貯藏保鮮等環(huán)節(jié)帶來了極大困難，造成的損失一般為20%～40%，嚴(yán)重時達60%[7]。目前，在果蔬的儲藏過程中主要還是采用物理防治和化學(xué)防治來控制采后病害，而前者操作難、要求設(shè)備可靠，后者污染嚴(yán)重。生物防治具有安全、有效、無殘留等生產(chǎn)優(yōu)點，具備可持續(xù)、環(huán)保、簡便與低能耗等技術(shù)優(yōu)勢，是保障農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和糧食生產(chǎn)的有效措施[8]，已成為當(dāng)今研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，用于防治番茄灰霉病的生防菌有綠僵菌、鏈霉菌、酵母菌、木霉、假單胞桿菌和芽孢桿菌[9-11]等，而用于番茄產(chǎn)后灰霉病的防治除拮抗酵母[12-13]外卻鮮有報道，酵母菌在采后果實病害的防治中雖已初具成效，但其生防效力有限[14]。芽孢桿菌被用于防治鱷梨、蘋果和臍橙等采后病害[15]，但未被證實用于防治番茄產(chǎn)后灰霉病的可靠性。

解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)B9601-Y2(Y2)，是筆者所在實驗室從小麥根系土壤中分離到的一株生防菌，有很好內(nèi)生能力，對水稻稻瘟病菌、水稻紋枯病菌、小麥根腐病菌、馬鈴薯晚疫病菌等30余種重要植物病原真菌有很強的抑制作用[16，17]。貝萊斯芽胞桿菌(Bacillusvelezensis)DJB5，是球花石斛的內(nèi)生菌，它既能抑制黃曲霉病原菌又能降解黃曲霉毒素，具有抑制、脫毒雙重功能和防治黃曲霉污染的應(yīng)用潛力[18]。為探索Y2和DJB5防治番茄產(chǎn)后灰霉病的可行性，從云南省姚安縣貯藏期采集疑似感染番茄灰霉病的果實，采用組織分離法分離和鑒定病原菌，并以Y2和DJB5開展生物防治研究，以期為番茄產(chǎn)后灰霉病的生物防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

試驗于2018年12月—2019年5月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室進行。

1.2 供試材料

番茄灰霉病菌疑似菌株FQ-2、生防菌株Y2、DJB5均由筆者所在實驗室分離和保存。番茄品種為‘瑞粉882’。培養(yǎng)基為PSA和LB。

1.3 試驗方法

1.3.1 病原菌分離 從云南省姚安縣番茄種植基地冷庫中采集罹病番茄果實，在超凈工作臺上，采用組織分離法分離病菌。將番茄病果用75%乙醇表面消毒和滅菌水清洗后，用解剖刀在病果的病健交界處切取3 mm×3 mm的組織塊，接種到含有硫酸鏈霉素(40 μg/mL)的PSA平板培養(yǎng)基上，放置于20℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)，待組織長出白色絮狀菌絲，使用接種針挑取菌落邊緣的菌絲塊轉(zhuǎn)接到新配制的PSA平板上進一步純化，從而獲得番茄病樣組織上的疑似病原菌，將其命名為FQ-2，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌株的制備

（1）接種體的制備。將疑似病原菌FQ-2、生防菌Y2和DJB5活化備用。用5 mm打孔器在已活化的病原菌平板上打孔，制備菌餅。在PSA平板上培養(yǎng)病菌孢子，用無菌水清洗，收集孢子懸浮液并用血球計數(shù)板計數(shù)，制成濃度為1.0×102cfu/mL的孢子懸浮液，備用。挑取Y2和DJB5單菌落轉(zhuǎn)接入新鮮無菌液體LB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，獲得發(fā)酵液，加入適量的無菌水將菌體濃度調(diào)整至1×106、1×107、1×108cfu/mL，備用。

（2）病原菌接種鑒定。將無病番茄果實用75%乙醇表面消毒并滅菌水清洗3次后晾干。用滅菌牙簽在番茄果實表面扎直徑1～2 mm小孔，放入含有孢子懸浮液的干凈燒杯中浸泡，或?qū)⒒颐共【鶩Q-2菌餅菌絲面朝下扣在備用的番茄果實傷口上，對照不浸泡孢子懸浮液或不接菌餅。把處理過的番茄果實置于20℃恒溫培養(yǎng)箱中光照黑暗各12 h交替保濕培養(yǎng)，觀察和記錄番茄果實的發(fā)病情況。

1.3.3 病原菌的形態(tài)及分子鑒定

（1）病菌形態(tài)鑒定。使用接種針挑取少量FQ-2的菌絲體制作玻片，顯微觀察病原菌的菌絲體及孢子形態(tài)。使用無菌水洗下病原菌的分生孢子，在AX10型光學(xué)顯微鏡(ZESS)200倍鏡下觀察病菌的分生孢子形態(tài)，并用Mshot數(shù)字成像系統(tǒng)測量300個分生孢子長寬直徑。

（2）基于rDNA-ITS擴增及測序的分子鑒定。使用無菌玻片從長滿FQ-2菌絲的PSA平板上刮取菌絲體（約200.0 mg），分別轉(zhuǎn)入2 mL無菌離心管內(nèi)，向其中加入400 μL/管EDTA(pH 8.0)，隨后使用無菌的鐵質(zhì)研磨棒將其搗碎成勻漿狀，再補加入200 μL/管EDTA(pH 8.0)，余下提取步驟參考文獻[19]。

使用真菌的ITS通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和 ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')擴增上述真菌的部分ITS1-5.8S-ITS4區(qū)域，預(yù)計擴增片段大小為750 bp。按如下比例配制PCR體系(20 μL)：無菌ddH2O 13.7 μL，10×EasyTaq Buffer(Mg2+)2.0 μL，5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，引物2.5 mmol/L的 ITS1和ITS4各1.0 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，F(xiàn)Q-2基因組DNA 0.5 μL(50 ng)。PCR擴增程序：94℃預(yù)變性4 min 30 s；94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸50 s，30個循環(huán)；72℃最終延伸10 min，16℃保存。PCR結(jié)束后，取5.0 μL PCR產(chǎn)物點樣于1.0%瓊脂糖凝膠的膠孔內(nèi)，90 V電泳40～50 min，檢測有無靶標(biāo)條帶的出現(xiàn)。隨后將PCR產(chǎn)物送交昆明擎科生物科技有限公司測序。

結(jié)合病菌形態(tài)和測序數(shù)據(jù)與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中的同源序列BLAST比對的結(jié)果，鑒定出上述病原真菌的種屬分類地位。選取一致性較高的同源序列，并以親緣關(guān)系較為疏遠的菌株作為組外參比對象(outgroup)，使用MEGA 5.0軟件，利用鄰接法運行Clustal W，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 Y2和DJB5對番茄果實灰霉病的預(yù)防試驗 在超凈工作臺中，用滅菌牙簽在消毒清洗干凈的番茄果實表面均勻地扎直徑1～2 mm小孔6個，分別放入制備好的Y2或DJB5濃度為1×106、1×107、1×108cfu/mL的菌液中浸泡5 min，晾干后，再分別于0、1、2、3、4和5天在FQ-2 1.0×102cfu/mL的孢子懸浮液中浸泡15 s，取出于室內(nèi)晾干（約30 min），每個處理5個果實，4次重復(fù)，以不浸泡Y2或DJB5菌液的果實為發(fā)病對照，以不接致病菌和Y2或DJB5菌液的果實為完全空白對照，在接種后的第10天，調(diào)查番茄果實病情并拍照記錄。

1.3.5 Y2和DJB5對番茄果實灰霉病的治療試驗 除病菌先接種、Y2或DJB5后接種外，其他步驟與1.3.4處理相同。

1.3.6 病情調(diào)查與統(tǒng)計分析 番茄灰霉病的發(fā)病百分面積依據(jù)發(fā)病面積占果實表面積百分數(shù)來計算，預(yù)防及治療的效果經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換后，采用SPSS 18.0軟件進行方差分析，并采用新復(fù)極差法(Duncan)比較各處理和對照差異顯著性，以不同字母表示處理間的差異顯著性水平。預(yù)防及治療的防治效果計算如式(1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 疑似病原菌對番茄果實致病性測定

從番茄上分離到疑似病原菌菌株FQ-2。根據(jù)柯赫氏法則，回接到健康的番茄果實上，結(jié)果無論是以菌絲塊或孢子懸浮液為接種體，均能引起番茄果實與先前病情癥狀相同。接種后3天接種點長出灰白色的菌絲，5天后形成圓形或近圓形的病斑，7天后菌絲顏色變?yōu)樯罨疑?，并開始產(chǎn)孢。從接種發(fā)病的番茄果實上再次分離病原菌，獲得的菌株與接種菌株形態(tài)完全一致（圖1）。

圖1 接種病原真菌后番茄果實的發(fā)病癥狀

2.2 病原真菌及孢子的形態(tài)

在AX10型光學(xué)顯微鏡(ZESS)下觀察，病原菌的分生孢子梗為淡褐色，呈不規(guī)則的樹狀分支。分生孢子梗末端膨大，著生大量分生孢子。分生孢子為單胞，呈亞球形或卵圓形，大小為(7.04～16.69)μm×(5.73～11.43)μm，其形態(tài)特征疑似葡萄孢屬真菌(Botrytissp.)。

2.3 病原真菌的分子鑒定

依據(jù)真菌的rDNA-ITS通用引物擴增序列，并在GenBank上搜索同源性片段，再聚類分析，菌株FQ-2的rDNA-ITS序列與編號Botrytiscinereaisolate YT-cp(MF 997491.1)菌株聚為同一支（圖2），相似度高達99%。依據(jù)FQ-2的形態(tài)和分子特點，將從番茄果實上分離到的病原菌FQ-2定名為灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)。

圖2 基于rDNA-ITS序列的菌株FQ-2發(fā)育進化樹

2.4 Y2和DJB5發(fā)酵液對番茄灰霉病的預(yù)防效果

在接種后第10天進行調(diào)查，未接種灰霉病菌完全空白對照的番茄未發(fā)病。未接種Y2和DJB5菌株但接種灰霉病菌的對照全部發(fā)病，發(fā)病百分面積達73.50%。隨著Y2和DJB5菌株處理后時間的推移，再接種灰霉病菌，病情越來越重。在當(dāng)天Y2以1×106、1×107和1×108cfu/mL 3個濃度浸泡番茄果實后再接種灰霉病菌的預(yù)防效果明顯，發(fā)病百分面積分別為24.00%、8.75%和23.00%（表1，圖3），即預(yù)防效果分別為67.35%、88.10%和68.71%。但隨著接種Y2后時間的推移，Y2的預(yù)防效果逐漸下降，如以1×107cfu/mL濃度的Y2在處理后1～5天的預(yù)防效果分別為47.28%、31.97%、31.63%、22.11%和17.01%。以相同濃度的DJB5浸泡番茄果實后，當(dāng)天接種病原菌，DJB5對番茄灰霉病的預(yù)防效果明顯，發(fā)病百分面積分別為27.50%、35.50%和19.50%（表1，圖4），預(yù)防效果分別為62.59%、51.70%和73.47%，不同濃度的預(yù)防效果差異不顯著。與Y2處理一樣，隨著接種病菌時間的推移，DJB5的防效亦逐漸降低，如1×108cfu/mL濃度處理番茄后1～5天再接種FQ-2，其預(yù)防效果分別為48.98%、30.95%、29.25%、17.01%和14.63%。

表1 Y2和DJB5菌液預(yù)防處理后番茄灰霉病百分面積 %

圖3 Y2發(fā)酵液處理后接種灰霉病菌的番茄病情

圖4 DJB5發(fā)酵液處理后接種灰霉病菌的番茄病情

2.5 Y2和DJB5對番茄灰霉病的治療效果

接種后第10天進行調(diào)查，未接種灰霉病菌空白對照的番茄未發(fā)病。只接種病原菌未接種Y2和DJB5菌株的對照全部發(fā)病，發(fā)病百分面積達83.50%?；颐共【幚砗蟛煌瑫r間接種Y2或DJB5，接種生防菌越晚病情越重。在接種1×102cfu/mL灰霉病菌的當(dāng)天接種1×106、1×107和1×108cfu/mL的Y2，治療效果明顯，發(fā)病百分面積分別為31.75%、40.50%和26.25%（表2，圖5），即治療效果分別為61.98%、51.50%和68.56%。但接種生防菌的時間距離接種病原菌的時間越長，其治療效果越差，如1×108cfu/mL濃度處理后1～5天，其治療效果分別為65.57%、63.47%、46.11%、32.34%和9.52%。與Y2類似，接種病原菌后當(dāng)天用3種濃度的DJB5處理的番茄發(fā)病百分面積分別為20.00%、17.75%和31.00%（表2，圖6），即治療效果分別為76.05%、78.74%和62.87%。接種灰霉病菌后1～5天，逐日用1×107cfu/mL DJB5處理的防效隨接種時間后移逐漸降低，治療效果分別為55.09%、54.49%、53.89%、40.12%和26.35%。

表2 Y2和DJB5菌液治療后番茄灰霉病百分面積 %

圖5 灰霉病菌處理后接種Y2發(fā)酵液的番茄病情

圖6 灰霉病菌處理后接種DJB5發(fā)酵液的番茄病情

3 結(jié)論與討論

番茄產(chǎn)后病害常導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。筆者調(diào)查了一家公司大棚生產(chǎn)的水果番茄灰霉病發(fā)生情況，田間看不到任何癥狀，但當(dāng)果實進入冷鏈運輸和中間轉(zhuǎn)港貯藏時，灰霉病發(fā)生率高達40%以上，個別批次基本失去商品價值。由于鮮果不宜采用化學(xué)農(nóng)藥防控，灰霉病幾近放任蔓延。為保證食品的安全性，生物防治成為果蔬采后病害防治的重要途徑。通過大量的研究發(fā)現(xiàn)，用于防治番茄灰霉病的生物防治方法主要有拮抗微生物、植物天然提取物[20-21]和植物精油[22-23]。在拮抗微生物中芽孢桿菌屬因產(chǎn)生抗逆性強的芽孢和抗菌物質(zhì)，并具有繁殖速度快等優(yōu)點，成為篩選果蔬采后病害拮抗菌的重要來源。如張立新等[24]研究表明，芽孢桿菌TY-6能有效防治櫻桃采后灰霉病菌。王丹[25]研究表明，蘇云金芽孢桿菌D-1菌懸液能有效控制油桃采后褐斑病的發(fā)生。目前，芽孢桿菌[26-27]用于防治番茄灰霉病的研究雖已有很多，但關(guān)于番茄產(chǎn)后灰霉病防治的研究卻相對較少。筆者采用柯赫氏法則證明番茄大量腐爛是由灰霉病菌侵染所引起的，并利用2株內(nèi)生菌（Y2和DJB5）有效地控制了番茄產(chǎn)后灰霉病的發(fā)生，這與解淀粉芽孢桿菌[28]和貝萊斯芽孢桿菌[29]可用于防治番茄灰霉病的報道基本一致。Y2是來自小麥根部具有內(nèi)生能力的菌株，DJB5是來自球花石斛莖部的內(nèi)生菌，它們是非常安全的，特別是DJB5經(jīng)系統(tǒng)安全性研究證明是安全的[30]，這些安全的內(nèi)生菌用于鮮果和蔬菜防霉具有極其廣闊的應(yīng)用前景。

Y2和DJB5的預(yù)防和治療效果均隨著處理時間的后延下降。在先接種生防菌再接種灰霉病菌的情況下，接種生防菌晾干后當(dāng)天接種灰霉病菌，在接種后第10天防效分別達88.10%和73.47%；而在接種生防菌后1天接種灰霉病菌，接種后第10天的防效相比當(dāng)天接種明顯下降，防效分別為47.28%和48.98%。在先接種灰霉病菌再接種生防菌的情況下，接種灰霉病菌晾干后當(dāng)天以Y2和DJB5處理，第10天的治療效果達68.56%和78.74%；在接種后1天以Y2和DJB5處理，第10天的治療效果下降至65.57%和55.09%。盡管從防治效果看，都未達到理想的效果，但本研究是采用刺傷果皮和高劑量灰霉病菌孢子(1×102cfu/mL)浸泡果實的條件下取得的，在第10天調(diào)查時，空白對照果實發(fā)病百分面積達73.50%（預(yù)防試驗）和83.50%（治療試驗），病情嚴(yán)重。筆者后來于采收后，直接以Y2和DJB5淋洗番茄果實，晾干后在整個冷藏過程中基本無灰霉病發(fā)生，表明這2株內(nèi)生菌具有實際應(yīng)用價值。然而，Y2和DJB5對其他作物產(chǎn)后灰霉病及其他病害是否有同樣的防控效果，還有待進一步試驗驗證。