范洪臣，王冰，馬永強(qiáng)

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150076)

腐乳因鮮美的味道、細(xì)膩的口感、獨(dú)特的風(fēng)味、多樣的品種和豐富的營養(yǎng)，被國外譽(yù)為“東方奶酪”，是微生物發(fā)酵白豆坯而成的傳統(tǒng)食品[1]。根據(jù)顏色、風(fēng)味與輔料的不同可將腐乳分成4大類：紅腐乳、白腐乳、青腐乳和其他類型腐乳[2]。腐乳中含有大量的蛋白質(zhì)、多種氨基酸、礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，營養(yǎng)價(jià)值較高[3]。根據(jù)菌種類型可將腐乳分為毛霉、根霉、細(xì)菌腐乳以及無菌腐乳[4]。黑龍江克東腐乳作為一種細(xì)菌型腐乳，在國內(nèi)眾多腐乳中獨(dú)樹一幟，具有明顯的地域特色，與霉菌型腐乳相比，含有大量鮮味的氨基酸，更加鮮美的滋味、鮮艷的色澤，質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味有很大的區(qū)別[5]。本文對近些年細(xì)菌型發(fā)酵腐乳的代表——克東腐乳在生產(chǎn)工藝、微生物、酶、化學(xué)組分、風(fēng)味、營養(yǎng)研究方面做一總結(jié)，并對克東腐乳的研究方向進(jìn)行展望，為細(xì)菌型發(fā)酵腐乳的科研和生產(chǎn)提供了借鑒。

1 克東腐乳生產(chǎn)工藝

克東腐乳以黑龍江地產(chǎn)非轉(zhuǎn)基因大豆為原料，以微球菌為生產(chǎn)菌種，經(jīng)過多道工序，長達(dá)6個(gè)月發(fā)酵，生產(chǎn)出的產(chǎn)品具有鮮艷的色澤、清香的味道、細(xì)膩柔軟的質(zhì)地和豐富的營養(yǎng)?？藮|腐乳富含蛋白質(zhì)及多種氨基酸，其中人體必需的氨基酸就有8種；富含多種維生素及微量元素，如鈣、鐵、鋅、硒等，是非常好的佐餐食品。克東腐乳加入了中草藥，產(chǎn)品亦有健脾補(bǔ)陽、溫中散寒、開胃止脹、解膻去膩、增進(jìn)食欲、幫助消化等特點(diǎn)[6]?？藮|腐乳同其他發(fā)酵工藝類似，生產(chǎn)工藝流程見圖1。

圖1 克東腐乳生產(chǎn)工藝

腐乳生產(chǎn)過程復(fù)雜，包括一系列的物理化學(xué)和生物化學(xué)反應(yīng)。從大豆的篩選、浸泡、磨漿、濾漿、煮漿，以酸或鹽點(diǎn)漿，到豆?jié){凝固后經(jīng)壓榨瀝水成豆腐，然后切成適當(dāng)?shù)男K成為白坯，都屬于物理化學(xué)過程[7]；白坯接種上微生物，經(jīng)過微生物的前酵和后酵，產(chǎn)生特殊的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味，此階段微生物生長代謝發(fā)生多種反應(yīng)都屬于生化反應(yīng)過程。腐乳的前酵過程包括菌種繁殖和酶解兩部分，菌種經(jīng)一段時(shí)間生長繁殖后在白坯表面形成致密的菌膜，分泌的酶可將原料分解成蛋白質(zhì)、肽、氨基酸和多糖等前體物質(zhì)，為后酵提供原料[8]；后酵過程主要包括加鹽腌制和添加酒精輔料進(jìn)行熟化兩部分，耐高滲透壓和酒精的多種微生物繼續(xù)降解坯體中蛋白質(zhì)大分子物質(zhì)，生成小分子肽、氨基酸及其他產(chǎn)物，與輔料中的化學(xué)物質(zhì)協(xié)同作用生成醇、醛、酸、酯等呈香化合物，經(jīng)過發(fā)酵后熟，腐乳形成了特有的色、香、味、體。

2 克東腐乳微生物研究

克東腐乳已有百余年歷史，其生產(chǎn)工藝以細(xì)菌型發(fā)酵而獨(dú)具特色?？藮|腐乳中菌種的確定與多樣性的研究經(jīng)歷了一個(gè)漫長的過程，研究的方法主要有傳統(tǒng)微生物分離方法和變性凝膠電泳技術(shù)。

白虹等利用傳統(tǒng)的微生物分離方法，在25 ℃、pH 7.0液體發(fā)酵培養(yǎng)條件下，從克東腐乳中分離純化出3株菌，檢測其生長及產(chǎn)酶活力。微生物學(xué)研究表明菌A，B均產(chǎn)蛋白酶，A為革蘭氏不定型芽孢桿菌，B為革蘭氏陽性芽孢桿菌；菌C不產(chǎn)蛋白酶，為革蘭氏陽性微球菌[9]。此結(jié)論與王潤芝等研究的克東腐乳主要微生物類群是細(xì)菌的結(jié)論一致[10]。

平板分離鑒定微生物是傳統(tǒng)食品發(fā)酵微生物研究的主要手段，從樣品中篩選出純菌株后進(jìn)行生理生化鑒定，確定樣品中存在的微生物種類及數(shù)量[11]。由于腐乳微生物復(fù)雜多樣，該方法只能篩選特定條件下的可培養(yǎng)微生物，占比例很大的不可培養(yǎng)微生物被忽略。因此，僅靠傳統(tǒng)培養(yǎng)方法不能全面揭示腐乳微生物的菌群結(jié)構(gòu)。變性凝膠電泳技術(shù)克服了難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的新菌無法被研究和利用的缺點(diǎn)，能夠高效地獲取樣品中微生物群落指紋和特征性核苷酸序列，突破了腐乳中微生物多樣性研究的瓶頸，成為微生物多樣性和菌群結(jié)構(gòu)變化的分子檢測技術(shù)之一，廣泛用于傳統(tǒng)食品發(fā)酵微生物多樣性的研究[12]。

馮鎮(zhèn)采用傳統(tǒng)平板分離技術(shù)和變性凝膠電泳技術(shù)研究了克東腐乳菌群的多樣性，采用傳統(tǒng)平板分離技術(shù)分離并鑒定出22種細(xì)菌，采用變性凝膠電泳技術(shù)鑒定出27種細(xì)菌，這兩種方法共同指出禽腸球菌(Enterococcusavium)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)是菌群中的主要優(yōu)勢菌，腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、巴黎鏈球菌(Streptococcuslutetiensis)、玫瑰色庫克菌(Kocuriarosea)、克氏庫克菌(Kocuriakristinae)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是亞優(yōu)勢菌。肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、玫瑰色庫克菌(Kocuriarosea)、克氏庫克菌(Kocuriakristinae)屬于凝固酶陰性球菌，凝固酶陰性球菌很重要，因?yàn)檫@些細(xì)菌具有亞硝酸鹽和硝酸還原酶活性，促進(jìn)腐乳紅色的形成和穩(wěn)定，限制了脂質(zhì)氧化和防止酸敗。糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)是克東腐乳菌群中的優(yōu)勢菌，它也出現(xiàn)在奶酪和霉菌發(fā)酵的腐乳中，它是爭議比較大的一種菌，有些研究者認(rèn)為該菌是受糞便污染的指示菌，另一方面有些研究人員也認(rèn)為該菌影響著發(fā)酵產(chǎn)品的重要風(fēng)味和作為生物保護(hù)劑。蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是亞優(yōu)勢菌，這兩種菌是意大利發(fā)酵香腸中的優(yōu)勢菌，這些芽孢菌有高的蛋白酶和脂肪酶活性，并且很多研究者認(rèn)為這兩種菌對人體的健康是有益的，因此這兩種菌可以作為克東腐乳的發(fā)酵劑[13]。

3 克東腐乳中酶的研究

腐乳釀造是由微生物主導(dǎo)的復(fù)雜的生化過程，微生物與其分泌的酶對腐乳口感和風(fēng)味的形成、積累有重要的影響，尤其是多種蛋白酶、脂肪酶的相互協(xié)同作用。腐乳發(fā)酵過程中各地區(qū)微生物、發(fā)酵條件、發(fā)酵時(shí)間不同，產(chǎn)生的酶及性質(zhì)也不同，所以各品牌腐乳的口感和風(fēng)味差別也較大。

孫冰玉等以克東腐乳為研究對象，對其生產(chǎn)過程中堿性蛋白酶、中性蛋白酶以及谷氨酰胺酶活力進(jìn)行監(jiān)測并分析，結(jié)果表明：在腐乳前酵階段，坯體中堿性蛋白酶、中性蛋白酶及谷氨酰胺酶活力隨時(shí)間的增加而升高；在腐乳后酵階段，坯體和湯汁中堿性蛋白酶的活力隨時(shí)間的增加而下降，中性蛋白酶的活力隨時(shí)間的增加而升高，而湯汁中谷氨酰胺酶活力略有上升，坯體中谷氨酰胺酶的活力變化不顯著[14]。

4 克東腐乳生產(chǎn)過程中化學(xué)組分的變化

克東腐乳前酵過程中，占主要地位的微球菌及其他菌在白坯上生長繁殖，相互協(xié)同作用分泌并積累蛋白酶、脂肪酶，從而對原料中的蛋白質(zhì)、脂肪進(jìn)行水解，為后酵提供前體物。克東腐乳后酵過程中，菌的自溶、酶的分解作用、復(fù)雜的生物化學(xué)貫穿始終。菌體自溶及酶分解蛋白質(zhì)形成的胨、多肽和氨基酸，微生物代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸、醇類和酯類等，這些成分最終賦予了腐乳特殊的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味。

鄒麗宏等以克東腐乳為研究對象，通過后酵生產(chǎn)過程中化學(xué)組分的變化，揭示各組分的變化規(guī)律，結(jié)果表明：在腐乳后酵階段，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)酵導(dǎo)致坯體中的粗蛋白、粗脂肪含量下降，但湯汁中的粗蛋白、游離脂肪酸含量上升；坯體及湯汁中游離氨基酸態(tài)氮、總酸含量、還原糖含量上升；坯體及湯汁中pH下降；食鹽含量恒定，而水分含量變化明顯[15]。

5 克東腐乳揮發(fā)性風(fēng)味研究

風(fēng)味是腐乳品質(zhì)和可接受性的重要感官屬性之一，揮發(fā)性風(fēng)味成分是腐乳特殊風(fēng)味的主要來源，主要由醇、酮、酸、醛、酯、醚和其他化合物組成，腐乳中除了揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)還有非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，如氨基酸、脂肪酸和呈味肽等，這些成分主要由微生物的氨基酸代謝、脂代謝、氧化還原反應(yīng)、乙醇發(fā)酵、酸發(fā)酵、Strecker降解和美拉德反應(yīng)形成[16]。目前克東腐乳中風(fēng)味物質(zhì)的提取方法有蒸餾-萃取法和固相微萃取法。

孫菁赫采用蒸餾萃取法提取揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)對白坯、坯體和湯料的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測，綜合分析了揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類及含量變化，結(jié)果表明：隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，酸、醛、酮、醇等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量都增加；酯類是主要的風(fēng)味物質(zhì)，但酯類物質(zhì)所占的百分比呈下降趨勢。

解春芝采用GC-MS技術(shù)測定8種腐乳樣品的游離脂肪酸譜，比較其游離脂肪酸的差異，并通過主成分分析法對其進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果表明：不同類型腐乳中，總游離脂肪酸含量為8.09～18.85 g/100 g，且存在顯著差異；共檢測出15種游離脂肪酸，亞油酸43.36%～50.74%、油酸22.29%～28.16%和棕櫚酸10.99%～13.72%為主要脂肪酸；這3種主要脂肪酸占總游離脂肪酸的98.71%，按游離脂肪酸含量的分值，克東腐乳在8種腐乳中排在第2位。究其原因：一方面，原料大豆和輔料中脂肪及游離脂肪酸含量存在差異，如克東腐乳主要以東北春大豆為原料，自然發(fā)酵型腐乳主要以云貴高原夏大豆為原料，而毛霉型腐乳由于分布廣泛，其原料的來源也較為多樣，包括黃淮海平原和長江流域夏大豆等；另一方面，不同腐乳的微生物區(qū)系不同，脂肪酶活力具有差異，進(jìn)而導(dǎo)致脂肪的降解程度也不盡相同[17]。

6 克東腐乳營養(yǎng)成分及功能性研究

腐乳中功能性物質(zhì)包括活性肽、不飽和脂肪酸、游離型大豆異黃酮以及不同種類的維生素和礦物質(zhì)等。原料中的蛋白質(zhì)和淀粉在微生物作用下發(fā)生改變，蛋白質(zhì)和淀粉分別被分解成氨基酸、多肽和單糖、低聚糖，這些小分子化合物易被人體吸收，營養(yǎng)價(jià)值較高[18]。對克東腐乳的營養(yǎng)成分與功能性研究較少，目前只有王鶴霖等對克東腐乳中低聚肽進(jìn)行了研究。王鶴霖分離、純化了克東腐乳中低聚肽，對其進(jìn)行了抗氧化活性研究，結(jié)果表明：低聚肽分子量越大，抗氧化活性越強(qiáng)，低聚肽清除自由基能力最大可達(dá)38.68%，脂質(zhì)體系抗氧化能力最大可達(dá)0.397 mg/kg[19]。

7 克東腐乳研究展望

克東腐乳是細(xì)菌發(fā)酵食品，同大多數(shù)霉菌發(fā)酵的腐乳相比，研究性論文數(shù)量較少。霉菌型腐乳在以下研究方面都有很大進(jìn)展：氨基酸、多肽、不飽和脂肪酸、短鏈脂肪酸、B族維生素、大豆皂苷、大豆異黃酮等營養(yǎng)物質(zhì)與功能的研究[20-25]；毛霉和根霉發(fā)酵條件對酶的影響[26]，蛋白酶與脂肪酶之間的相互關(guān)系[27-28]，酶活性變化[29]；霉菌型腐乳風(fēng)味物質(zhì)組成及變化規(guī)律[30-32]；毛霉和根霉發(fā)酵對腐乳品質(zhì)的影響[33-34]；菌種多樣性的研究，尤其是高通量基因測序技術(shù)對腐乳菌群及風(fēng)味之間關(guān)系的研究[35-38]。黑龍江克東腐乳地域特色明顯，與霉菌型腐乳相比，因較高的氨基酸含量使其滋味更加鮮美、質(zhì)地柔軟而綿長；發(fā)酵過程中細(xì)菌代謝與霉菌代謝有很大的區(qū)別。因此，克東腐乳可以借鑒霉菌型腐乳的研究方法，在營養(yǎng)物質(zhì)與功能、酶、風(fēng)味物質(zhì)、微生物組成與多樣性方面積極開展研究。