上官宇晨，黃麗媛，黃熊，何傳波，魏好程，熊何健*

(1.集美大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省漳州市漳浦縣海洋與漁業(yè)局，福建 漳州 363200)

仙草(MesonaBlume.)又名仙人草，為唇形科(Labiatae)涼粉草屬(MesonaBl.)，主要分布于我國福建、廣東、廣西等省份，作為一種藥食兩用的植物資源[1]，廣泛應(yīng)用于涼茶、燒仙草和龜苓膏等傳統(tǒng)食品的加工[2]?！吨腥A本草》中記載仙草味甘、性寒，有清暑涼血及利尿之功效?，F(xiàn)有研究表明，仙草還具有抗氧化、防中暑、降血壓、治療關(guān)節(jié)疼痛等的功效，且黃酮類物質(zhì)是仙草主要的功能成分之一。傳統(tǒng)仙草產(chǎn)品的加工工藝較為單一，為提高仙草多糖的提取率和增加燒仙草的風(fēng)味，加工過程中常加入較高濃度的堿進(jìn)行堿煮，長時(shí)間高溫堿處理對仙草中的黃酮類化合物會產(chǎn)生極大的破壞[3]，造成仙草黃酮資源的浪費(fèi)。

黃酮類物質(zhì)的分子量較小，易被人體消化吸收，具有抗氧化、抗菌、降血糖及降膽固醇等功能[4-7]，在食品與醫(yī)藥行業(yè)應(yīng)用廣泛[8-9]。黃酮類化合物可以作甜味劑、增鮮劑用于增加調(diào)味品的風(fēng)味，也可以作為功能性調(diào)味品的功效成分[10]，仙草黃酮的分離純化能為開發(fā)相關(guān)功能性調(diào)味品、保健食品提供研究基礎(chǔ)。

大孔樹脂吸附是依靠樹脂和被吸附物質(zhì)之間的范德華引力、靜電作用或氫鍵的作用達(dá)到分離、凈化的目的，具有操作簡便、富集效果明顯、穩(wěn)定性好、選擇性強(qiáng)、可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)[11-12]，廣泛應(yīng)用于花色苷、多酚、黃酮類物質(zhì)的分離純化[13-14]。近年來，關(guān)于大孔樹脂吸附植物中黃酮的研究較多，但來源于不同植物的黃酮類物質(zhì)極性及組成有所不同，所選用的大孔樹脂的類型差異較大。極性是反映樹脂解吸能力的重要因素，極性越大，樹脂對黃酮的解吸能力越弱[15]。Sephadex LH-20具有清潔、簡單、高效等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于分離天然活性物質(zhì)，適用于黃酮組分的分離[16]。

目前國內(nèi)仙草的研究主要集中于仙草多糖及相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)，仙草黃酮的研究尚處于起步階段。本研究采用大孔樹脂柱層析法純化仙草黃酮，并進(jìn)一步分離、鑒定出兩個(gè)主要組分，為工業(yè)化制備仙草黃酮提供了技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

仙草：產(chǎn)自福建省龍巖市；蘆丁、甲醇：均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大孔吸附樹脂(HPD-100)：滄州寶恩化工有限公司；Sephadex LH-20：瑞典GE Healthcare公司；乙腈：美國Sigma公司；甲酸：阿拉丁公司；氘代甲醇：色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

玻璃層析柱(Φ16 mm×200 mm)和(Φ20 mm×600 mm)；HD-21-88自動(dòng)柱層析儀 上海琪特分析儀器有限公司；JDG-0.2冷凍干燥機(jī) 蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司；Ultimate 3000高效液相色譜儀 Dionex公司；Avance Ⅱ 400 MHz全數(shù)字化核磁共振譜儀 瑞士Bruker公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 仙草黃酮的提取及含量的測定

仙草黃酮提取液的配制：取100 g仙草粉末(過80 目篩)，以1∶15 (g/mL)的料液比加入45%乙醇溶液，25 ℃恒溫水浴提取2 h，提取2次，合并濾液，減壓濃縮回收乙醇，濃縮液過濾、離心(4000 r/min，20 min)，定容至250 mL，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

含量的測定：參考Yang等[17]的方法并稍作修改，采取NaNO2-Al(NO3)3法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0011x+0.0251，R2=0.9998，在0.0～400 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，總黃酮含量計(jì)算公式見式(1)，將樣品適度稀釋后同上法測定并計(jì)算樣品黃酮含量。

式(1)

式中：W為樣品黃酮含量，mg/g；C為樣品液中蘆丁濃度，μg/mL；V為樣品液體積，mL；n為樣品測定時(shí)的稀釋倍數(shù)；M為樣品的質(zhì)量，g。

1.2.2 大孔樹脂HPD-100靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

稱取2.0 g預(yù)處理的HPD-100樹脂置于150 mL錐形瓶中，加入50 mL仙草黃酮提取液(20 mg/mL)，置于恒溫振蕩器(30 ℃、150 r/min)中反應(yīng)1，2，4，6，8，12，24 h，過濾，樹脂用蒸餾水充分清洗，加入45%乙醇50 mL于相同條件下洗脫24 h后過濾，分別測定各樹脂平衡液和解吸液中黃酮的濃度，繪制其靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線，見公式(2)和公式(3)。

式(2)

D=(C2×V2)/[(C0-C1)×V1)]×100%。

式(3)

式中：Q為樹脂吸附量，mg/g；C0為吸附前樣液初始濃度，mg/mL；C1為大孔樹脂吸附后樣液濃度，mg/mL；D為解吸率，%；C2為大孔樹脂解吸后樣液濃度，mg/mL；V1為樣液初始體積，mL；V2為解吸液體積，mL；W為大孔樹脂質(zhì)量，g。

1.2.3 大孔樹脂HPD-100純化條件優(yōu)化

1.2.3.1 上樣量的選擇

稱取10 g HPD-100大孔樹脂濕法裝柱。取10 mg/mL仙草黃酮溶液進(jìn)行上樣，上樣流速3 BV/h(1 BV 10 mL)，上樣量1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15 BV，振蕩吸附后(25 ℃，150 r/min，24 h)，水洗，再用3 BV 60%濃度的乙醇溶液解吸，測定各組洗脫液中黃酮含量。

1.2.3.2 上樣流速的選擇

按上述實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件上樣，分別以1，2，3，4，5 BV/h的流速通過樹脂，吸附8 h，按式(2)測定最終的吸附量。

1.2.4 優(yōu)化大孔樹脂(HPD-100)分離純化仙草黃酮工藝中動(dòng)態(tài)吸附、解吸實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 洗脫液濃度的選擇

按上述實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件上樣，待上柱吸附完全后，用蒸餾水洗至流出液無檢出黃酮，分別用30%、40%、50%、60%、70%乙醇以6 BV/h的流速洗脫，每5 min收集一管，測定每管流出液中黃酮的濃度。

1.2.4.2 洗脫流速的選擇

按上述實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件上樣，待上柱吸附完全后，用蒸餾水洗至流出液無檢出黃酮，再分別用1，3，6 BV/h的60%乙醇洗脫，每5 min收集一管，測定每管流出液中黃酮的濃度。

1.2.5 Sephadex LH-20分離仙草黃酮組分

按上述優(yōu)化條件柱層析純化仙草黃酮提取液，洗脫液真空濃縮、凍干后得到仙草黃酮樣品(crudeMesonaBlume. flavonoids，CMBF)。用甲醇配制10 mg/mL CMBF樣品液，過濾處理后，于Sephadex LH-20層析柱(Φ16 mm×60 mm)分離，用30%、50%、70%、90%甲醇各100 mL進(jìn)行梯度洗脫，洗脫速度為0.5 mL/min，每7 min收集一管，用HPLC檢測并收集合并相同吸收峰的樣品，然后進(jìn)行真空減壓濃縮，冷凍干燥后，冷藏備用，進(jìn)行下一步的分析鑒定。

1.2.6 高效液相色譜分析

采用高效液相色譜分析純化后的仙草黃酮組分，分析條件：流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%甲酸，C18色譜柱(Agilent ZORBAX SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)，進(jìn)樣體積：10 μL，檢測波長：280 nm，柱溫：30 ℃，梯度洗脫：0～10 min，90%～80% B，10～35 min，80%～70% B，35～55 min，70%～90% B，流速1 mL/min。

1.2.7 核磁共振譜分析

依據(jù)參考文獻(xiàn)[18],取5 mg的仙草黃酮純化組分MBF1、MBF2溶解于0.5 mL DMSO-d6中并轉(zhuǎn)移至專用的核磁管內(nèi)，以四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)物，在Bruker核磁共振儀上測定氫譜1H-NMR、13C-NMR。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文所有實(shí)驗(yàn)樣本均設(shè)3次平行，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，統(tǒng)計(jì)分析采用Origin 9.0和MestReNova軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 仙草黃酮在HPD-100樹脂上的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

由圖1可知，在0～8 h內(nèi)，隨著吸附時(shí)間的延長，樹脂的吸附量也隨之增加。吸附8 h后，隨著時(shí)間的增長，曲線趨于平緩，樹脂基本達(dá)到飽和吸附量。在1～2 h內(nèi)，HPD-100樹脂吸附速度較快，吸附量快速接近飽和吸附量的90%，解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HPD-100的解吸率最高為(86.47±0.27)%，說明HPD-100大孔吸附樹脂對仙草黃酮有良好的吸附效果。

圖1 HPD-100大孔樹脂的靜態(tài)吸附曲線

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的確定

2.2.1 上樣量的確定

由圖2可知，隨著粗提液上樣量的增加，流出液中黃酮的質(zhì)量濃度增大。上樣量為3 BV時(shí)，流出液中仙草黃酮的濃度為(0.51±0.07) mg/mL，約為上樣液濃度的5%。當(dāng)上樣量高于3 BV時(shí)，流出液中仙草黃酮的濃度快速上升，吸附的黃酮發(fā)生大量泄漏，因此選擇上樣量為3 BV時(shí)樣品泄漏的損失最小。

圖2 上樣量對HPD-100大孔樹脂吸附仙草黃酮的影響

2.2.2 上樣流速的確定

由圖3可知，HPD-100樹脂對仙草黃酮的吸附量隨著上樣流速的增加而減少，可能是由于大孔樹脂的吸附速度有限，在同樣的吸附速率下流速加快、相對吸附時(shí)間減少，同時(shí)流速過大，導(dǎo)致有效成分與樹脂接觸時(shí)間不充分，不能被樹脂吸附完全。但流速過慢，影響了生產(chǎn)效率，延長了生產(chǎn)周期，增加了生產(chǎn)成本。與上樣流速1 BV/h相比，在3 BV/h的流速條件下，HPD-100樹脂對仙草黃酮的吸附量僅下降了(4.23±0.08)%。而單位時(shí)間內(nèi)粗提物的上樣量提高了2倍。綜合考慮，選擇3 BV/h為最佳上樣流速。

圖3 上樣流速對HPD-100大孔樹脂吸附仙草黃酮的影響

2.2.3 洗脫濃度的確定

由圖4可知，用30%乙醇洗脫時(shí)，流出液黃酮的濃度最低，且洗脫峰不集中，有拖尾峰。用60%乙醇濃度洗脫樹脂時(shí)，流出液黃酮的濃度最大。當(dāng)乙醇濃度上升或者下降時(shí)，洗脫量降低，這可能是在60%乙醇的極性條件下易破壞仙草黃酮與HPD-100大孔樹脂的作用位點(diǎn)，使得仙草黃酮容易被置換，提高了解吸的效率。綜合考慮，選擇最佳洗脫劑為60%乙醇。

圖4 洗脫劑濃度對HPD-100大孔樹脂解吸仙草黃酮的影響

2.2.4 洗脫速率的確定

由圖5可知，當(dāng)洗脫流速為3 BV/h時(shí)，仙草黃酮解吸濃度最高，但洗脫峰形不均一，洗脫時(shí)間長，效率較低。當(dāng)洗脫流速達(dá)到9 BV/h時(shí)，仙草黃酮解吸濃度最低，有較明顯的拖尾峰，這可能是因?yàn)榱魉龠^快，吸附的黃酮類物質(zhì)未被完全洗脫下來。當(dāng)洗脫流速為6 BV/h時(shí)，黃酮解吸濃度較高且洗脫峰較為對稱。綜合考慮，最佳洗脫流速為6 BV/h。

圖5 洗脫速率對HPD-100大孔樹脂解吸仙草黃酮的影響

2.3 仙草黃酮的分離與結(jié)構(gòu)鑒定

仙草黃酮提取液經(jīng)大孔樹脂純化、真空濃縮、凍干后得到仙草黃酮樣品(crudeMesonaBlume. flavonoids，CMBF)，利用Sephadex LH-20柱層析對CMBF進(jìn)一步分離得2 個(gè)化合物MBF1、MBF2。HPLC分析結(jié)果見圖6，CMBF峰形較雜，兩種組分MBF1、MBF2均由單一峰組成，且2個(gè)樣品純度都達(dá)到90%以上，確定2種物質(zhì)為單一化合物，進(jìn)行核磁共振譜分析。

圖6 仙草黃酮液相色譜圖

MBF1，褐色粉末，分子量為360.0845，分子式為C18H16O8，1H-NMR(CD3OD, 400 MHz): δH7.49 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7), 7.02(1H, d, J=1.6 Hz, H-2), 6.91(1H, dd, J=8.2, 1.6 Hz, H-6), 6.75 (1H, d, J=8.2 Hz, H-5), 6.75 (1H, br s, H-2′), 6.66 (1H, d, J=8.0 Hz, H-5′), 6.62 (1H, br d, J= 8.0 Hz, H-6′), 6.26 (1H, d, J=15.9 Hz, H-8), 5.09 (1H, br d, J=8.0 Hz, H-8′), 3.09 (1H, br d, J=13.3 Hz, H-7′b), 2.92 (1H, dd, J=13.3, 8.0 Hz, H-7′a)。13C-NMR (CD3OD, 100 MHz): δC169.1 (s,C-9),149.4 (s, C-4),146.7 (s, C-3),146.6 (d, C-7),146.0 (s, C-3’),144.8 (s, C-4’),131.2 (s, C-1’),128.0 (s, C-1),122.9 (d, C-6),121.8 (d, C-6’),117.5 (d, C-2’),116.5 (d, C-5’),116.2 (d, C-5),115.7 (d, C-8),115.1 (d, C-2), 38.8 (t, C-7’)。上述光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]對比基本一致，可確定MBF1為迷迭香酸(見圖7)。

MBF2，淺黃色粉末，分子量為448.1006，分子式為C21H20O11，1H-NMR (CD3OD, 400 MHz): δH8.04 (2H, d, J=8.8 Hz, H-2’, H-6’), 6.88 (2H, d, J=8.8 Hz, H-3’, H-5’), 6.38 (1H, br s, H-8), 6.19 (1H, br s, H-6), 5.22 (1H, d, J=7.2 Hz, H-1′), 3.68 (1H, dd, J=11.9, 2.1 Hz, H-6’′a), 3.52 (1H, dd, J=11.9, 5.5 Hz, H-6’′b), 3.27-3.47(3H, m, H-2’’,H-3’’,H-4’’), 3.19 (1H, ddd, J = 9.7, 5.5, 2.1 Hz, H-5’’)。13C-NMR (CD3OD, 100 MHz): δC179.4 (s, C-4), 166.6 (s, C-7),163.0 (s, C-5),161.6 (s, C-4’),159.0 (s, C-2),158.5 (s, C-9),135.4 (s, C-3),132.3 (d, C-2’, C-6’),122.8 (s, C-1’),116.1 (d, C-3’, C-5’),105.5 (s, C-10),104.1 (d, C-1’’),100.1 (d, C-6),94.9 (d, C-8),78.4 (d, C-5’’), 78.0 (d, C-3’’), 75.7 (d, C-2’’), 71.3 (d, C-4’’), 62.6 (t, C-6’’)。上述光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]對比基本一致，可確定MBF2為紫云英苷(見圖7)。

圖7 MBF1、MBF2的結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論

黃酮類化合物在食品保鮮、抑菌方面應(yīng)用廣泛，為了更好地利用仙草中的黃酮類化合物，本研究通過考察HPD-100大孔樹脂對仙草黃酮的吸附和解吸能力，發(fā)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)HPD-100樹脂吸附量能快速達(dá)到飽和吸附量的90%，解吸率最高為(86.47±0.27)%，可以認(rèn)為HPD-100大孔樹脂是分離仙草黃酮的一種理想樹脂。其最佳純化工藝參數(shù)為：上樣量為3 BV，上樣流速為3 BV/h，洗脫劑乙醇濃度為60%，洗脫流速為6 BV/h。經(jīng)Sephadex LH-20進(jìn)一步分離純化得到兩個(gè)單體化合物，通過1H-NMR、13C-NMR進(jìn)行鑒定，確定兩種純化物為迷迭香酸與紫云英苷。

本實(shí)驗(yàn)采用大孔樹脂法純化仙草黃酮，操作簡單，效果明顯，仙草原料經(jīng)乙醇溶液提取黃酮后，仍可加工仙草膠類傳統(tǒng)食品。仙草黃酮的分離制備及進(jìn)一步的功能活性研究有助于仙草黃酮保健食品以及調(diào)味食品的高效開發(fā)。