羅婉瑩 曹敏 竇文婷 田睿 林敏 任來(lái)春 王浩華 鄒原方

GD 是甲狀腺功能亢進(jìn)癥(甲亢)的最常見(jiàn)病因,約占全部甲亢的80%～85%,臨床表現(xiàn)主要為：①甲狀腺毒癥；②彌漫性甲狀腺腫；③眼征；④脛前黏液性水腫［1］。GD 具有遺傳易感性特點(diǎn),其發(fā)病機(jī)制尚未明確,臨床認(rèn)為與自身免疫、遺傳、環(huán)境因素有關(guān),其中自身免疫為主要因素。在多種因素作用下,GD 可使機(jī)體免疫功能下降,導(dǎo)致抗原特異或非特異性抑制性T 細(xì)胞(Ts)發(fā)生缺陷、功能下降,繼而削弱對(duì)輔助性T 細(xì)胞(Th)的抑制作用,加上Th 不適當(dāng)致敏和白細(xì)胞介素-1(IL-1)、IL-2 等的共同參與,使特異性B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生大量異質(zhì)性免疫球蛋白(自身抗體)［2］。其中NKT 細(xì)胞兼有NK 細(xì)胞和T 細(xì)胞的特性,具有雙向免疫調(diào)節(jié)功能［3］。本研究旨在探討GD 患者外周血中NKT 細(xì)胞及其細(xì)胞因子(IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α)的表達(dá),從而探討GD 的發(fā)病機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018 年1 月～2019 年12 月在本院確診的19 例GD 患者作為實(shí)驗(yàn)組,另選擇同期19 例健康志愿者作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組患者均符合第7 版內(nèi)科學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］,其中男5 例,女14 例；年齡18～59 歲,平均年齡(36.7±8.3)歲。對(duì)照組男11 例,女8 例；年齡18～59 歲,平均年齡(37.3±7.9)歲。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 外周血NKT 細(xì)胞檢測(cè)方法 儀器：貝克曼庫(kù)爾特FC500MCL 流式細(xì)胞儀。試劑：?jiǎn)慰寺】贵wCD45-FITC、CD3-PC5、CD56-PE、RBC 裂解液(貝克曼公司提供)。步驟：在同一流式專用試管中加入上述單克隆抗體(CD45-FITC、CD3-PC5、CD56-PE)各5 μl,同時(shí)加入EDTA 抗凝全血50 μl,混勻,避光孵育20 min；加入RBC 裂解液500 μl 裂解20 min；加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS) 500 μl 上機(jī)檢測(cè)。用CD45/SS 設(shè)門圈定淋巴細(xì)胞群,在十字門圖中分析CD3+與CD56+雙陽(yáng)性區(qū)域細(xì)胞百分比,即為CD3+CD56+NKT 細(xì)胞百分比(NKT細(xì)胞百分比)。

1.2.2 血清中細(xì)胞因子及甲狀腺功能指標(biāo)檢測(cè)方法 儀器：BPC-1000 化學(xué)發(fā)光儀；試劑：IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α 等細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(BPC 公司提供)。實(shí)驗(yàn)步驟：患者均于清晨6:00 空腹采取靜脈血3 ml(使用外周血促凝管),離心,取上清。使用化學(xué)發(fā) 光法檢測(cè)血清中IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α 水平；電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)FT3、FT4、TSH、TPOAb 水平。其中IL-2 的正常參考值為0.08～5.71 pg/ml,IL-10 的正常參考值為0.19～4.91 pg/ml,檢測(cè)值為非正常范圍內(nèi)即為陽(yáng)性。

1.3 觀察指標(biāo) 檢測(cè)并比較兩組甲狀腺功能指標(biāo)(FT3、FT4、TSH、TPOAb)、IL-6、TNF-α 及NKT 細(xì)胞水平,IL-2、IL-10 陽(yáng)性率,探討FT4、TSH、TPOAb與NKT 細(xì)胞及細(xì)胞因子的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差() 表示,采用t 檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(第25 百分位數(shù),第75 百分位數(shù))［M(P25,P75)］ 表示,組間比較采用Mann-Whitney 秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson 相關(guān)分析；以TSH、TPOAb 作為因變量,以IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、NKT 細(xì)胞水平作為自變量,進(jìn)行多重回歸分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組甲狀腺功能指標(biāo)、IL-6、TNF-α、NKT 細(xì)胞水平比較 實(shí)驗(yàn)組FT3、FT4、TPOAb、TNF-α 和NKT 細(xì)胞水平均高于對(duì)照組,TSH 和IL-6 水平均低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組甲狀腺功能指標(biāo)、IL-6、TNF-α 及NKT 細(xì)胞水平比較［,M(P25,P75)］

表1 兩組甲狀腺功能指標(biāo)、IL-6、TNF-α 及NKT 細(xì)胞水平比較［,M(P25,P75)］

注：與對(duì)照組比較,aP＜0.05

2.2 兩組L-2、IL-10 陽(yáng)性率比較 實(shí)驗(yàn)組IL-2和IL-10 陽(yáng)性率均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組IL-2、IL-10 陽(yáng)性率比較［n(%)］

2.3 FT4、TSH、TPOAb 與NKT 細(xì)胞及細(xì)胞因子的相關(guān)性分析 IL-2、IL-10、TNF-α、NKT 細(xì)胞水平與FT4、TSH 和TPOAb 水平密切相關(guān),IL-6 水平與TSH水平密切相關(guān)(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 FT4、TSH、TPOAb 與NKT 細(xì)胞及細(xì)胞因子的相關(guān)性分析

2.4 甲狀腺功能、TPOAb 與NKT 細(xì)胞及其細(xì)胞因子的關(guān)系 以TSH 水平為因變量,IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、NKT 細(xì)胞水平為自變量,采用進(jìn)入法納入變量,結(jié)果顯示IL-10水平與TSH水平呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。見(jiàn)表4。以TPOAb 水平為因變量,IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α 和NKT 細(xì)胞水平為自變量,采用進(jìn)入法納入變量,結(jié)果顯示IL-10 水平與TPOAb 水平呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。見(jiàn)表5。

表4 以TSH 為因變量的多重回歸

表5 以TPOAb 為因變量的多重回歸

3 討論

GD 是甲亢的最常見(jiàn)病因,其中T 細(xì)胞介導(dǎo)引起血清TPOAb、抗甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)、TSH 受體抗體(TRAb)水平異常,是其重要特點(diǎn),但GD 患者甲狀腺相關(guān)抗體的產(chǎn)生目前研究較少,其機(jī)制尚不清楚。

NKT 細(xì)胞具有T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞的特性,可同時(shí)表達(dá)NK 細(xì)胞受體NK1.1(CD161)和恒定的T 細(xì)胞抗原受體(TCR)αβ 受體,其表型和功能與免疫細(xì)胞(B 細(xì)胞、T 細(xì)胞及NK 細(xì)胞等)卻有差異,是特殊類型的淋巴細(xì)胞,而且可對(duì)由CD1d 分子呈遞的特異性糖脂類分子抗原進(jìn)行識(shí)別,并迅速分泌大量白細(xì)胞介素-4(IL-4)、γ干擾素(IFN-γ)、IL-10、白細(xì)胞介素-13(IL-13)等細(xì)胞因子,參與機(jī)體先天性免疫及獲得性免疫,具有雙向免疫調(diào)節(jié)功能,從而在抗感染、抗腫瘤及抑制自身免疫疾病方面發(fā)揮重要作用［5］。研究發(fā)現(xiàn),NKT 細(xì)胞參與了GD 的發(fā)病過(guò)程,在各種微環(huán)境下其可釋放不同的細(xì)胞因子,從而對(duì)Th0 向Th1、Th2 的分化進(jìn)行調(diào)節(jié),完成不同的免疫應(yīng)答［6］。本研究結(jié)果顯示,GD 患者NKT 細(xì)胞水平顯著高于健康人,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；且NKT 細(xì)胞水平與患者甲狀腺功能密切相關(guān)(P＜0.05)。提示NKT 細(xì)胞在GD 發(fā)病過(guò)程中起重要作用,與相關(guān)研究結(jié)果一致,但NKT 細(xì)胞在GD 具體發(fā)病過(guò)程中起何種作用,國(guó)內(nèi)外缺乏相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,作者猜測(cè)NKT 細(xì)胞通過(guò)分泌相關(guān)細(xì)胞因子,調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫及體液免疫,從而影響GD 發(fā)病過(guò)程。

IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α 是NKT 細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子,在細(xì)胞毒作用和免疫調(diào)節(jié)中扮演著重要角色。有研究發(fā)現(xiàn),NKT 細(xì)胞分泌IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α 影響Th0 向Th1/Th2 分化,參與GD 的發(fā)生,Th0 細(xì)胞向Th1 的極化,具體表現(xiàn)為Th1 活化后分泌IL-2、TNF-α 等細(xì)胞因子,Th1 活化后主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答［7-11］,其中林莉等［12］報(bào)道,Th1 的活化(細(xì)胞免疫介導(dǎo))與GD 的發(fā)病有關(guān),此外Th2 的活化(體液免疫介導(dǎo))可誘導(dǎo)產(chǎn)生甲狀腺相關(guān)抗體和GD 發(fā)病,但在GD 發(fā)病中細(xì)胞免疫與體液免疫如何相互發(fā)揮作用,國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道,這也是本次研究的重點(diǎn)。本次研究結(jié)果中,IL-2、IL-10、TNF-α、NKT 細(xì)胞水平與FT4、TSH 和TPOAb 水平密切相關(guān)(P＜0.05)；提示NKT 細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子在GD 患者甲狀腺功變化中有著特殊意義；且實(shí)驗(yàn)組TNF-α 水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；提示在GD 發(fā)病中 Th1 存在活化,但GD 患者IL-10 水平顯著下降,Th2 存在明顯抑制；此外,多重回歸分析結(jié)果表明,當(dāng)TPOAb 高水平時(shí),IL-10 表達(dá)受到抑制,以上結(jié)果均支持Th2 活化受到一定抑制。本次研究表明,NKT 細(xì)胞及其細(xì)胞因子可能介導(dǎo)了GD 患者Th0 細(xì)胞向Th1 為主要極化,細(xì)胞免疫可能是GD 發(fā)病早期的主要免疫應(yīng)答方向,后續(xù)甲狀腺相關(guān)抗體升高,可能在Th1 活化基礎(chǔ)上體液免疫應(yīng)答的結(jié)果。有文獻(xiàn)報(bào)道,GD Th 的偏移有階段性變化,可能早期向Th1 極化,后期向Th2 極化為主［7］,這與本次研究一致。另外,本研究結(jié)果顯示,Th1 的細(xì)胞因子IL-2 在GD 患者中表達(dá)顯著減少,猜測(cè)可能是由患者處于不同疾病階段、細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性、抗甲狀腺藥物的干擾和實(shí)驗(yàn)方法條件不同所導(dǎo)致。后續(xù)需要大量臨床及基礎(chǔ)研究進(jìn)一步揭示GD 患者Th1/Th2極化因素及相互關(guān)系,這有利于進(jìn)一步明確GD 的發(fā)病機(jī)制。

綜上所述,GD 發(fā)病過(guò)程中NKT 細(xì)胞水平增高,并可能通過(guò)分泌相關(guān)細(xì)胞因子介導(dǎo)Th0 向Th1 的分化,但由于研究樣本數(shù)量局限、患者發(fā)病時(shí)間未能有效一致及可能存在多種細(xì)胞因子相互作用,對(duì)結(jié)果可能存在一定干擾,需要大樣本臨床研究及相關(guān)基礎(chǔ)研究進(jìn)行明確,對(duì)于將來(lái)有望開(kāi)展特異性免疫干預(yù)治療,為臨床提供更為有效的診治手段。