王薇 馬慶海 張小玲 蘇烏云 常麗娟 王小蘭 李瑤 閆海成★

膠質(zhì)瘤是臨床上腦內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤，占所有腦惡性腫瘤的80%［1］。膠質(zhì)瘤治療后容易復(fù)發(fā)，臨床上對(duì)膠質(zhì)瘤的治療仍有一定的困難［2］。因此，迫切需要對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)展的機(jī)制進(jìn)行研究，尋找診斷和治療的新方法。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［3］。長基因間非編碼RNA 1088（long intergenic non-coding RNA 1088，LINC01088）是長鏈非編碼RNA 中的一種，其在卵巢癌發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用［4-5］，但在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用尚不清楚。本研究通過干擾LINC0108的表達(dá)分析LINC01088對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、遷移和侵襲以及血管生成的影響，探討LINC01088在膠質(zhì)瘤中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

MTT 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（Cat.No.C0009）和極超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（Cat.No.P0018FM）：碧云天公司；U251 細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；siRNA 序列購于廣州市銳博；TRIzol Reagent（Cat.No.15596026）、Lipo-fectamine 2000（Cat.No.11668019）、SuperScript II Reverse Transcriptase（Cat.No.18064014）和 EX-PRESS One-Step Superscript qRT-PCR Kit（Cat.No.11781200）：美國Invitrogen 公司；Transwell 小室（Cat.No.353097）和Matrigel 凝膠（Cat.No.356234）：美國BD 公司；PI3K 抗體（Cat.No.365290）、AKT 抗體（Cat.No.5298）、p-AKT 抗體（Cat.No.377556）、GAPDH 抗體（Cat.No.47724）和m-IgGκ BP-HRP 抗體（Cat.No.516102）：美國Santa cruz 公司；ABI Prism?快速7500 型熒光定量PCR 儀：美國Applied Biosystems 公司；倒置光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS CKX41，U-CTR30-2）：日本OLYMPUS 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析LINC01088在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

利用生物信息學(xué)在線工具GEPIA（http：//ge-pia.cancer-pku.cn/detail.php）分析LINC01088在膠質(zhì)瘤組織和正常組織中的表達(dá)（標(biāo)本數(shù)據(jù)來源于TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫）。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及穩(wěn)定細(xì)胞株篩選

用含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)U251 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株。小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞，操作按照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。在轉(zhuǎn)染中設(shè)置對(duì)照（si-NC）組，si-LINC01088-1組、si-LINC01088-2組、si-LINC01088-3組。然后將篩選出的si--LINC01088用于穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建，感染實(shí)驗(yàn)分為LINC01088沉默組和對(duì)照組。

1.2.3 qRT-PCR

收集U251 細(xì)胞，Trizol 試劑提取總RNA，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，定量PCR 檢測(cè)LINC01088表達(dá)。以U6 作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法表示LINC01088相對(duì)表達(dá)。

1.2.4 MTT

將感染后的膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞接種至96 孔板中，隨后按照MTT 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)0、24、48、72 h在570 nm 波長下的吸光度。

1.2.5 Transwell

遷移實(shí)驗(yàn)：將Transwell 小室放置于24 孔板內(nèi)，將感染后的膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞接種于上室。培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛溶液對(duì)小室膜下面的細(xì)胞進(jìn)行固定，然后用0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：將Matrigel基質(zhì)膠按照說明書對(duì)Transwell小室底部膜的上室進(jìn)行包被，其余同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 血管擬態(tài)

按照王帆等［6］血管擬態(tài)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備Matrigel 膠和培養(yǎng)板，將準(zhǔn)備好的各組細(xì)胞每孔按1×105個(gè)加入24 孔板中。培養(yǎng)24 h，利用共聚焦顯微鏡拍攝記錄結(jié)果，計(jì)數(shù)各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞血管生成的形成水平。

1.2.7 Western blot

RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，取各組變性30 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳并電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。膜封閉后加入一抗（PI3K 按1∶500 稀釋，AKT按1∶1 000 稀釋，p-AKT 按1∶500 稀釋，GAPDH 按1∶2 000 稀釋）。隨后加入HRP 標(biāo)記二抗。最后用化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行蛋白印跡條帶成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q 分析。兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析LINC01088 在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

GEPIA 分析結(jié)果顯示，與正常組織相比，膠質(zhì)瘤組織中的LINC01088表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

圖1 INC01088 在膠質(zhì)瘤組織和正常組織中的表達(dá)水平Figure 1 The relative expression level of LINC01088 in glioma tissues and normal tissues was analyzed

2.2 轉(zhuǎn)染si-LINC01088 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞LINC01088表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)染24 h 后，與si-NC組相比，si-LINC01088組細(xì)胞中LINC01088表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），si-LINC01088-1干擾效率最高。見表1。

表1 轉(zhuǎn)染si-LINC01088 對(duì)膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞中LINC01088 表達(dá)的影響（±s）Table 1 Effect of transfected with si-LINC01088 on the expression of LINC01088 in glioma U251 cells（±s）

表1 轉(zhuǎn)染si-LINC01088 對(duì)膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞中LINC01088 表達(dá)的影響（±s）Table 1 Effect of transfected with si-LINC01088 on the expression of LINC01088 in glioma U251 cells（±s）

注：與20 nM 對(duì)照組比較，aP<0.05；與50 nM 對(duì)照組比較，bP<0.05；與100 nM 對(duì)照組比較，cP<0.05。

組別si-NC si-LINC01088-1 si-LINC01088-2 si-LINC01088-3 F 值P 值相對(duì)LINC01088 表達(dá)20 nM 1.01±0.02 0.55±0.03a 0.63±0.02a 0.58±0.03a 10.342 0.008 50 nM 1.01±0.02 0.26±0.02b 0.53±0.02b 0.42±0.02b 15.326<0.001 100 nM 1.02±0.02 0.25±0.02c 0.42±0.02c 0.38±0.02c 18.543<0.001

2.3 慢病毒載體滴定與細(xì)胞感染效率

與對(duì)照相比，LINC01088沉默組LINC01088的表達(dá)量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=45.346，P<0.001）。見圖2。

圖2 sh-LINC0108 慢病毒重組載體感染293T 細(xì)胞和U251 細(xì)胞圖（GFP 熒光，×200）Figure 2 Sh-LINC0108 lentivirus recombinant vector infected 293T cells and U251 cells.（GFP fluorescence，×200）

2.4 沉默LINC01088 對(duì)U251 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和血管擬態(tài)能力的影響

與對(duì)照相比，LINC01088沉默組細(xì)胞在24、48和72 h 的增殖顯著降低（P<0.05）。與對(duì)照相比，LINC01088沉默組遷移細(xì)胞顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），侵襲細(xì)胞顯著減少（P<0.001），管狀數(shù)量也顯著減少（P<0.001）。見表3、圖3。

表3 沉默LINC01088 對(duì)U251 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及血管形成的影響（±s）Table 3 Effect of silencing LINC01088 on proliferation and migration of U251 cells（±s）

表3 沉默LINC01088 對(duì)U251 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及血管形成的影響（±s）Table 3 Effect of silencing LINC01088 on proliferation and migration of U251 cells（±s）

注：與24 h 對(duì)照組比較，aP<0.05；與48 h 對(duì)照組比較，bP<0.01；與72 h 對(duì)照組比較，cP<0.001。

組別對(duì)照組LINC01088 沉默組t 值P 值細(xì)胞活性（OD570nm）0 h 0.33±0.02 0.35±0.01 1.625 0.180 24 h 0.51±0.02 0.41±0.01a 13.39<0.001 48 h 0.76±0.02 0.57±0.02b 14.36 0.006 72 h 0.98±0.03 0.63±0.02c 26.74<0.001遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)）287.67±5.35 190.5±8.80a 23.10<0.001侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)）254.67±7.66 113.67±3.14a 41.72<0.001微管狀數(shù)目前（個(gè)）34.67±3.50 13.00±5.40a 8.242<0.001

圖3 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)圖、侵襲及血管生成實(shí)驗(yàn)圖（結(jié)晶紫染色，×200）Figure 3 Cell migration in control group and LINC01088 silencing group.(Crystal violet staining,×200)

2.6 沉默LINC01088 對(duì)U251 細(xì)胞中PI3K、p-AKT和AKT 蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，LINC01088沉默組U251 細(xì)胞中PI3K 和p-AKT 蛋白表達(dá)水平顯著下降。見圖4。

圖4 細(xì)胞血管生成實(shí)驗(yàn)圖（×200）Figure 4 Cell angiogenesis of control（×200）

3 討論

膠質(zhì)瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多基因參與調(diào)控的過程，大量研究證實(shí)LncRNA 在其發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用［7］。越來越多的研究表明，異常表達(dá)的LncRNA 經(jīng)常在包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種癌癥發(fā)現(xiàn)，有些表現(xiàn)出促進(jìn)癌癥的發(fā)展作用［8］，也有些表現(xiàn)出抑制癌癥的發(fā)展作用，還有些在不同的癌癥中所表現(xiàn)的功能也不盡相同［9］。如LncRNA SNHG1 能促進(jìn)膠質(zhì)瘤的葡萄糖攝取、增殖、遷移、侵襲和血管生成［10］。LncRNA MT1JP 通過激活PTEN/AKT 信號(hào)通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡［11］。LncRNA XIST在結(jié)直腸癌、膀胱癌和胃癌中以致癌的方式存在，而在乳腺癌和前列腺癌中也被證明發(fā)揮抑制腫瘤的作用［12-16］。因此，研究LncRNA 在不同類型腫瘤中作用同樣具有重要的意義。

LINC01088是一個(gè)較新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，目前對(duì)它有研究還很少，其在膠質(zhì)瘤中的作用尚未見報(bào)道。最近Zhang 等［4］研究發(fā)現(xiàn)，與正常卵巢組織相比，卵巢良性腫瘤組織中LINC01088的表達(dá)明顯降低，LINC01088對(duì)裸鼠卵巢癌移植瘤的生長有抑制作用，發(fā)揮抑癌作用。Ai 等［5］研究發(fā)現(xiàn)LINC01088低表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理特征相關(guān)與上皮性卵巢癌FIGO 分期、分級(jí)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，而且LINC01088表達(dá)水平越低總體生存率較差。以上研究表明LINC01088在卵巢癌中可以作為預(yù)后標(biāo)志物，發(fā)揮抑癌作用。本研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織中的LINC01088相對(duì)表達(dá)水平明顯高于正常組織，沉默LINC01088能顯著抑制U251 細(xì)胞的增殖，同時(shí)還能抑制細(xì)胞遷移和侵襲。這些結(jié)果與Zhang 等和Ai 等研究LINC01088在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)和作用相反，這可能與LINC01088在不同類型腫瘤中發(fā)揮不同的作用有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)沉默LINC01088能顯著抑制膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞的血管生成能力。

PI3K/AKT 信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，對(duì)細(xì)胞的生存、增殖和代謝等關(guān)鍵功能起著重要的調(diào)控作用［17］。該信號(hào)通路活化能夠細(xì)胞周期進(jìn)程加快從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時(shí)也對(duì)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移起促進(jìn)作用，AKT 是PI3K 信號(hào)途徑的一個(gè)重要下游靶激酶，在許多癌癥中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)磷酸化激活A(yù)KT［18］。本研究發(fā)現(xiàn)沉默LINC01088能下調(diào)PI3K 和p-AKT 蛋白的表達(dá)，表明沉默LINC01088對(duì)PI3K/AKT 信號(hào)通路有抑制作用。提示LINC01088在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成中所起的作用可能與其調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，沉默LINC01088能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和血管生成，其作用機(jī)制可能與其抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路有關(guān)。LINC01088可能是膠質(zhì)瘤干預(yù)治療的潛在靶點(diǎn)。