韓冠華 林曉濤 孟慶勇 何林 錢純亙 程邦寧★ 徐軍發(fā)★

特發(fā)性炎性肌?。╥diopathic inflammatory my-opathy，IIM）是一組以對(duì)稱性四肢近端肌無(wú)力為特征表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫性結(jié)締組織病，基于臨床癥狀及免疫病理特征，可將其分為不同的亞型，臨床上常見(jiàn)的亞型是皮肌炎（dermatomyositis，DM）。隨著研究的深入，陸續(xù)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)IIM 患者血清中存在特異性的自身抗體，且此類抗體與IIM 患者的臨床表現(xiàn)和預(yù)后相關(guān)，有助于指導(dǎo)臨床醫(yī)生為患者制定個(gè)體化的治療方案［1-2］。其中抗轉(zhuǎn)錄中介因子1-γ（TranscriptionalIntermediary Factor 1-gamma，TIF1-γ）抗體是TARGOFF 等［3］于2006年通過(guò)免疫沉淀法（immunoprecipitation，IP）首次在肌炎患者血清中發(fā)現(xiàn)的一種自身抗體，后續(xù)的多項(xiàng)研究指出抗TIF1-γ 抗體可作為監(jiān)測(cè)DM 患者繼發(fā)惡性腫瘤的生物標(biāo)志物［4］。檢測(cè)抗TIF1-γ 抗體的金標(biāo)準(zhǔn)是IP，但由于該方法涉及培養(yǎng)及使用細(xì)胞，步驟繁瑣，且需要使用放射性標(biāo)記物，并不適用于臨床檢測(cè)。目前臨床上檢測(cè)抗TIF1-γ 抗體最常用的是抗肌炎抗體譜IgG 檢測(cè)試劑盒（歐蒙印跡法），但基于不同方法學(xué)之間特異性和敏感度會(huì)存在一定差異，應(yīng)結(jié)合臨床癥狀和其它檢測(cè)方法（如ELISA、化學(xué)發(fā)光法等）對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合分析［5-6］?；谏鲜霰尘?，本研究將分析TIF1-γ 重組蛋白作為診斷抗原的臨床應(yīng)用價(jià)值，為開(kāi)發(fā)抗TIF1-γ IgG 抗體檢測(cè)方法提供核心原料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞、SF9 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒提取試劑盒、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Ther-mo 公司；Flag 層析填料購(gòu)自MBL 公司；抗Flag 標(biāo)簽鼠單克隆抗體購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；封閉液、偶聯(lián)物穩(wěn)定劑、TMB 底物購(gòu)自湖州英創(chuàng)生物科技有限公司；鼠抗人IgG-HRP 購(gòu)自菲鵬生物股份有限公司；PCR 儀、酶標(biāo)儀為BioRad 公司產(chǎn)品。

1.1.2 標(biāo)本來(lái)源

抗TIF1-γ IgG 抗體陽(yáng)性血清21 例，抗Jo-1 IgG 抗體、抗Scl-70IgG 抗體、抗雙鏈DNA（dsDNA）抗體、類風(fēng)濕因子（RF）和抗核抗體（ANA）各5 例，共25 例（疾病對(duì)照組）以及健康體檢者血清44 例（健康對(duì)照組），由本實(shí)驗(yàn)室收集并保存，均已分離血清并保存在-80℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)質(zhì)粒pFastBac1-TIF1-γ 的構(gòu)建

從Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到人TIF1-γ 氨基酸序列（ID：Q9UPN9），按照昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)偏好對(duì)TIF1-γ 序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，在C-端同時(shí)引入3×Flag 序列，委托通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。合成的TIF1-γ 基因?yàn)? 462 bp，其中5′端含BamHI 酶切位點(diǎn)，3′端含XhoI 酶切位點(diǎn)，經(jīng)BamHI和XhoI 雙酶切后插入到pFastBac1 載體，表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序及雙酶切鑒定確認(rèn)構(gòu)建的正確性。

1.2.2 TIF1-γ 重組蛋白的表達(dá)與純化

將pFastBac1-TIF1-γ 轉(zhuǎn)化DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞，使用LB 瓊脂平板（含50 μg/mL 卡那霉素、10 μg/mL 四環(huán)素、7 μg/mL 慶大霉素、100 μg/mL X-gal 和40 μg/mL IPTG）進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，分別挑取藍(lán)斑和白斑擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)物用于提取重組桿粒，具體操作參考質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書。使用M13 Forward/M13 Reverse 引物對(duì)重組桿粒進(jìn)行PCR 鑒定。將鑒定正確的Bacmid-TIF1-γ 轉(zhuǎn)染至SF9 細(xì)胞，27℃培養(yǎng)72 h，500 g 離心15 min 收集上清即為第一代重組病毒（P1）；P1 用于感染正常SF9 細(xì)胞，擴(kuò)增病毒得到P2；通過(guò)相同的方法得到P3，將P3 加入到懸浮培養(yǎng)的SF9 細(xì)胞，27℃，110 rpm 培養(yǎng)72 h，收獲細(xì)胞并進(jìn)行離心和超聲處理，收集細(xì)胞裂解液，通過(guò)Flag 親和層析柱進(jìn)行純化，收集表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE 和Western-Blot 分析。

1.2.3 抗TIF1-γ IgG 抗體-ELISA 的建立

TIF1-γ 重組蛋白包被96 孔板（400 ng/孔），商品化封閉液封閉；血清按1∶100 稀釋，每孔100 μL，37℃孵育1 h；PBS-T 洗板3 次后加入1∶10 000稀釋的HRP 標(biāo)記的鼠抗人IgG，100 μL 每孔，37℃孵育30 min；再次清洗后，加入TMB 底物，37℃孵育10 min；最后加入終止液，酶標(biāo)儀讀取OD 值。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，通過(guò)繪制受試者工作特征曲線（receiver opera-tion characteristic，ROC），確定自建抗TIF1-γ IgG抗體-ELISA 檢測(cè)臨界（cut-off）值。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)質(zhì)粒pFastBac1-TIF1-γ 的構(gòu)建及鑒定

電泳結(jié)果顯示出現(xiàn)兩條特異性條帶，其中一條位置約在3 400 bp 處為TIF1-γ 基因，另一條位置約在4 700 bp 處為載體pFastBac1。見(jiàn)圖1。

圖1 pFastBac1-TIF1-γ 雙酶切鑒定結(jié)果Figure 1 Restriction enzyme identification of pFastBac1-TIF1-γ

2.2 重組桿粒Bacmid-TIF1-γ 的鑒定

已發(fā)生轉(zhuǎn)座的Bacmid- TIF1-γ 條帶位置約在5 700 bp 處，未發(fā)生轉(zhuǎn)座的Bacmid 條帶位置約在300 bp 處。見(jiàn)圖2。

圖2 Bacmid-TIF1-γ 擴(kuò)增結(jié)果Figure 2 PCR result of the Bacmid-TIF1-γ

2.3 TIF1-γ 重組蛋白表達(dá)和純化

表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE 分析，目的蛋白條帶位置約在150 kD 處。Western-Blot 結(jié)果顯示，該目的條帶能與抗Flag 標(biāo)簽抗體特異性結(jié)合。見(jiàn)圖3～4。

圖3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析Figure 3 SDS-PAGE analysis of expression protein products

圖4 TIF1-γ 重組蛋白Western-Blot 檢測(cè)Figure 4 The detection of TIF1-γ recombinant protein by Western Blot

2.4 抗TIF1-γ IgG 抗體-ELISA 檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示，OD 值=0.273 時(shí)約登指數(shù)最大，因此把cut-off 值選定為0.273，此時(shí)敏感度為100%，特異性為97.1%。見(jiàn)圖5。

圖5 抗TIF1-γ IgG 抗體-ELISA ROC 曲線Figure 5 ROC curve of anti-TIF1-γ antibody-ELISA

3 討論

TIF1-γ 蛋白屬于TRIMs（Tripartite motif-con-taining）家族蛋白，具有一個(gè)RING 結(jié)構(gòu)域，可作為泛素連接酶E3 發(fā)揮作用，在腫瘤發(fā)生過(guò)程中扮演著重要的角色，如參與凋亡相關(guān)蛋白P53 的調(diào)控、抑制TGF-β 信號(hào)通路的活性等，推測(cè)這些蛋白的自身抗體可能是腫瘤發(fā)生過(guò)程中產(chǎn)生的，從而促進(jìn)癌癥的發(fā)生［7-8］?？筎IF1-γ 抗體可作為監(jiān)測(cè)IIM 患者繼發(fā)惡性腫瘤的生物標(biāo)志物。臨床上對(duì)于抗TIF1-γ 抗體陽(yáng)性的IIM 患者，應(yīng)注意密切隨訪，及時(shí)進(jìn)行相關(guān)的腫瘤檢測(cè)。IP 被視為檢測(cè)該類自身抗體的金標(biāo)準(zhǔn)，但它并不適用于常規(guī)的臨床檢測(cè)，面對(duì)不斷增長(zhǎng)的患者數(shù)量，建立有效、可靠、快速和簡(jiǎn)便的抗TIF1-γ 抗體檢測(cè)方法非常有必要。為了驗(yàn)證現(xiàn)有試劑的性能以及開(kāi)發(fā)出更符合臨床需求的抗TIF1-γ 抗體檢測(cè)試劑，Aggarwal 等［9］以O(shè)riGene 公司的純化全長(zhǎng)TIF1-γ重組蛋白作為包被抗原建立了基于ELISA 的抗TIF1-γ 抗體的檢測(cè)方法與IP 進(jìn)行比較，總體符合率為93.9%，有高度的一致性（κ=0.87）。Mahler 等［10］用歐蒙印跡法與IP 共同測(cè)試一批DM 患者血清，其中抗TIF1-γ 抗體項(xiàng)目總體符合率為94.9%，κ=0.71（P<0.05），一致性較好。上述研究表明，以歐蒙抗肌炎抗體譜IgG 檢測(cè)試劑盒為代表的IB 檢測(cè)方法與金標(biāo)準(zhǔn)IP 有較好的一致性，同樣的，以ELISA 為原理所建立的檢測(cè)方法也有望替代IP。

本研究測(cè)試過(guò)程中發(fā)現(xiàn)2 例與歐蒙印跡法測(cè)試結(jié)果不符的樣本，推測(cè)出現(xiàn)不符的原因有以下幾點(diǎn)，一是包被抗原的純度。本研究得到的重組蛋白經(jīng)純化后通過(guò)SDS-PAGE 分析，存在較明顯的非目的條帶，猜測(cè)是目的蛋白降解產(chǎn)物，是否因此而產(chǎn)生了非特異性結(jié)合還有待驗(yàn)證。二是固相載體材料的不同。ELISA 和IB 的固相材料分別為聚苯乙烯和硝酸素纖維膜，因此包被工藝可能會(huì)存在差異。如將蛋白包被在硝酸素纖維膜后，一般需要進(jìn)行一定時(shí)間的烘干，此過(guò)程對(duì)蛋白的活性可能會(huì)造成一定的影響，而蛋白質(zhì)與酶標(biāo)板的結(jié)合則是通過(guò)物理吸附作用，包被條件相對(duì)溫和。三是反應(yīng)體系的不同。封閉液和緩沖液的選擇，如鹽離子的濃度、表面活性劑的種類及用量、是否需要添加額外的蛋白成分或阻斷劑等都有可能對(duì)測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生影響。四是不同方法學(xué)之間特異性和敏感度會(huì)存在一定差異，且抗TIF1-γ IgG 抗體的檢測(cè)目前沒(méi)有可溯源的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)于測(cè)試結(jié)果有存在爭(zhēng)議的樣本，應(yīng)參考不同技術(shù)平臺(tái)的檢測(cè)結(jié)果并結(jié)合患者臨床表現(xiàn)進(jìn)行綜合分析［11-12］。綜合上述四個(gè)方面，后續(xù)需通過(guò)金標(biāo)準(zhǔn)或第三方ELISA 試劑驗(yàn)證兩例假陽(yáng)性樣本是否為“真陰性”。另外有文獻(xiàn)報(bào)道，兩種自身抗體各自對(duì)應(yīng)的靶抗原（Mi-2β 和TIF1-γ）有相似的氨基酸序列，抗Mi-2β 抗體會(huì)和TIF1-γ 蛋白結(jié)合，出現(xiàn)交叉反應(yīng)［13］。后續(xù)仍需收集并測(cè)試更多疾病對(duì)照組樣本，探討是否存在能與本研究制備的TIF1-γ 重組蛋白結(jié)合的自身抗體，進(jìn)一步評(píng)估自建ELISA 的特異性。綜上所述，本研究得到的TIF1-γ 重組蛋白在體外診斷試劑研發(fā)方面具有較好的應(yīng)用前景，為開(kāi)發(fā)抗TIF1-γ IgG 抗體檢測(cè)方法提供了核心原料?；诖酥亟M蛋白初步建立的抗TIF1-γ IgG 抗體-ELISA 是一種特異和靈敏的血清學(xué)檢測(cè)方法，對(duì)臨床診斷和治療皮肌炎患者有一定的應(yīng)用價(jià)值，可作為現(xiàn)有免疫印跡法試劑的良好補(bǔ)充。