左鳳梅 盧佳慧 劉雅文 倪晨 時梅林 胡俊峰

近年來，以多功能納米顆粒為基礎，將診斷與治療整合為一個系統(tǒng)，可以提高臨床療效，減少治療的副作用，為癌癥的精確診療提供了新的思路［1-3］。目前，乳腺癌的治療包括手術切除、化療、放療等［4-6］。然而，這些方法也會對健康組織造成嚴重損害。因此，一種新型的腫瘤治療方法-光熱療法（Photothermal therapy，PTT）被提出［7］。PTT療法是利用光敏劑將光轉化為熱，在激發(fā)光照射下，腫瘤部分迅速升溫殺傷腫瘤細胞［8］。本研究使用吲哚菁綠（Indocyanine green，ICG）作為光敏劑，ICG 是一種近紅外熒光染料，在激光照射后具有良好的光熱轉換效率和較高的生物安全性，但游離情況下穩(wěn)定性差，血液循環(huán)壽命短。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

透射電子顯微鏡（Tecnai G2 F20，美國），馬爾文粒徑分析儀（Nano ZS90，英國），紫外分光光度計（Uvmini-1240，日本），808 激光儀（MDL-N-808-8W，中國），多功能酶標儀（Biotek，美國），超聲波破碎儀（JY92-IIDN，中國），超聲成像儀（Philip，荷蘭），熒光倒置顯微鏡（DMI3000B，美國），3.0T磁共振成像設備（GE Discovery 750w，美國）；聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA，分子量10 000，聚合比50∶50，Evonik，德國），氯化錳（Manganese（II）chloride，MnCl2，北陸藥業(yè)，中國），全氟戊烷（Perfluoropen-tane，PFP，阿拉丁，中國），吲哚菁綠（ICG，麥克林，中國），聚乙烯醇（PVA，Sigma，美國）；MDA-MB-231，NIH-3T3 細胞株（中科院上海細胞庫，中國），細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8，美侖，中國）。

1.2 PMINPs 的制備

將100 mg 的PLGA 加入4 mL 的二氯甲烷，待充分溶解后加入200 μL 的PFP，2 mg ICG，200 μL MnCl2冰浴下超聲破碎2 min 分鐘（100 W），得到的初乳液緩慢滴入20 mL 2%PVA 溶液，超聲破碎5 min（50 W）制成復乳，冰浴下攪拌8 h 揮發(fā)二氯甲烷，轉速10 000 r/min 洗滌離心，重復三次后凍干備用，制備全程避光低溫。

1.3 PMINPs 一般性質(zhì)檢測

使用透射電子顯微鏡觀察材料的形貌和結構；使用馬爾文粒徑儀分析PMINPs 的粒徑大小、PDI 及電位。采用紫外分光光度法計算ICG 的標準曲線，根據(jù)標準曲線來計算PMINPs 中ICG 的包封率。

1.4 細胞毒性檢測和PMINPs 的攝入

MDA-MB-231 和NIH-3T3 細胞在96 孔板中孵育，37℃條件下，每孔培養(yǎng)1×104個細胞，孵育12 h。實驗組每孔加入100 μL 含有不同濃度PMINPs 的培養(yǎng)基。孵育6 h，采用細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）檢測PMINPs 的細胞毒性。將熒光標記物香豆素-6 裝入PMINPs 中，細胞孵育1、2、3 h 后，采用DAPI（4′，6-diamidino-2-phenylindole）對細胞核進行染色，制片后使用倒置熒光顯微鏡進行觀察。

1.5 光熱性能檢測

給予808 nm 激光輻照（1.5 w/cm2，5 min），用紅外熱成像儀記錄各組溫度變化。隨后游離的ICG 和PMINPs 根據(jù)ICG 濃度配制成25 μg/mL 的溶液，取100 μL 置于96 孔板中，由808 nm 激光開-關循環(huán)輻照重復4 次（開1 min，關2 min），用紅外熱成像儀記錄各組溫度變化。

取對數(shù)生長期的MDA-MB-231 細胞與材料孵育6 h 后分組處理，用CCK-8 評價各組的細胞毒性。材料與細胞孵育6 h 后處理四個分組，激光照射后分別用鈣黃綠素-AM（Calcein-AM）和碘化丙啶（PI）處理細胞，采用活死細胞染色法定性考察光熱效果。

1.6 超聲/磁共振雙模成像

1.6.1 超聲（Ultrasound，US）

顯微鏡下觀察激光照射（1.5 w/cm2）下PMINPs的變化。將軟管浸入水中，采用808 激光照射（1.5 w/cm2），使用超聲成像儀觀察是否成像。

1.6.2 磁共振（Magnetic Resonance，MR）

在3.0 T Discovery 750 W MR系統(tǒng)上對PMINPs進行T1 加權成像研究。用自旋回波序列對稀釋后的樣品進行MRI 掃描。此外，利用MDA-MB-231細胞的體外MR 成像試驗評價其對乳腺癌細胞的磁共振成像能力。MDA-MB-231 細胞與不同濃度PMINPs 孵育6 h。將細胞消化離心收集并用PBS洗滌，使用前面描述的磁共振成像系統(tǒng)進行磁共振成像。磁共振掃描參數(shù)：重復時間=16 ms，回波時間=3.2 ms，視野=8 cm×8 cm，層厚=0.4 mm，層間距=0.5 mm，矩陣=320×288。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用IBM SPSS Statistics 24 軟件處理分析數(shù)據(jù)，計量資料以（）形式表示，采用t檢驗和單因素方差分析，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PMINPs 一般性質(zhì)

所制備的納米粒子具有明顯的核/殼結構，粒徑均勻，分散性強（圖1A）。如圖1B 所示，PMINPs的尺寸為（211.10±2.66）nm，PDI 為0.12。Zeta 電位為（-17.50±0.65）mV。圖1C 中可以看出，PFP/MnCl2@PLGA NPs 的吸收光譜沒有明顯的吸收峰，而自由ICG 的吸收光譜在770～790 nm 左右達到峰值。PMINPs 的吸收光譜在790～810 nm 處出現(xiàn)峰值通過紫外吸收光譜確定ICG 標準曲線為y=0.247 5x-0.072 5（r=0.999）（圖1D）。在此基礎上計算ICG 的平均包封率為（76.38±0.32）%，平均載藥量為（6.99±3.98）%。

圖1 PMINPs 的表征Figure 1 Characterizations of PMINPs

2.2 細胞毒性檢測和攝入

CCK-8試驗結果顯示當濃度到達160 μg/mL時，PMINPs 對MDA-MB-231和NIH-3T3細胞均無明顯細胞毒性，不同濃度吸光度值差異無統(tǒng)計學意義，且細胞活力都在90%以上（圖2A）。從圖2B 中可以看出，隨著時間的推移，MDA-MB-231細胞中出現(xiàn)代表PMINPs的綠色熒光且隨著時間的增加而變量。

圖2 PMINPs 的體外細胞毒性和細胞攝取Figure 2 In vitro cytotoxicity and cellular uptake of PMINPs

2.3 光熱性能檢測

經(jīng)過808 nm 激光輻照后，PMINPs 升溫顯著，與ICG 的濃度呈正相關（圖3A）。經(jīng)過4 個激光開-關循環(huán)后，PMINPs 仍可以較穩(wěn)定的產(chǎn)熱，升溫峰值只降低了3.3℃，而游離ICG 產(chǎn)熱能力則明顯下降關（圖3B）。

如圖3C 所示，不同濃度的PMINPs 在沒有激光照射的情況下細胞活性沒有明顯下降。在近紅外激光照射下，隨著PMINPs 濃度的增加，癌細胞的消融作用增強。對于PFP/MnCl2@PLGA NPs，由于光敏劑ICG 的缺乏，激光照射后的加熱效果不明顯，對腫瘤細胞的損傷也很難觀察到。如圖3D 所示，僅激光照射，PMINPs 處理對細胞無明顯殺傷作用。

圖3 PMINPs 光熱性能檢測Figure 3 PMINPs photothermal performance test

2.4 超聲/磁共振雙模成像

2.4.1 超聲

隨著輻照時間的延長，微泡膨脹到一定體積后開始破裂（圖4A）。相應的，在808 nm 近紅外激光照射前，透明塑膠軟管中PMINPs 的超聲成像效果沒有增強。當激光照射后，PFP 氣化，產(chǎn)生氣泡，并發(fā)生明顯的超聲成像增強（圖4B）。

圖4 超聲成像Figure 4 US imaging

2.4.2 磁共振

PMINPs 的磁共振信號強度隨著Mn 濃度的增加而增強，見圖5A。PMINPs 在細胞中具有很好的磁共振成像能力，并且是濃度依賴性的，見圖5B。

圖5 磁共振成像Figure 5 MR imaging

3 討論

根據(jù)已有研究可知，錳離子可以增強T1 信號，能顯著提高病灶與周圍良性組織的對比度。本研究中選用MnCl2作為磁共振造影劑。制備的納米粒子將MnCl2包裹在內(nèi)，由于MnCl2將會隨著納米載體在機體血液及組織內(nèi)流通循環(huán)，會大大提高其在機體內(nèi)的循環(huán)時間，從而給磁共振成像診斷提供充足的時間。磁共振成像是一種具有精細軟組織對比和多平面成像能力的無創(chuàng)成像工具，但通常需要較長的采集時間，不能提供實時圖像［9］。相比之下，超聲可以提供實時圖像，但在組織識別方面能力與磁共振相比略差［10］。在許多臨床應用中，超聲和磁共振是互補的，以區(qū)別可能的病理改變組織［11］。已有許多前人開發(fā)了相應造影劑，可以達到超聲/磁共振共同成像的目的［12-13］。在這項工作中，筆者用了第三代造影劑全氟戊烷，在室溫下以液體形式存在，而在注射進入人體以后，當達到相變溫度，發(fā)生液氣相變變?yōu)闅鈶B(tài)，達到超聲顯影增強目的［14］。

所研制的納米粒子具有粒徑適宜、穩(wěn)定性高的特點。粒徑在200 nm 左右的PMINPs 可通過實體瘤的高通透性和滯留效應在腫瘤部位富集。因此，在近紅外激光照射下，富集在腫瘤部位的光敏劑ICG 迅速升溫殺傷腫瘤而對正常組織的殺傷作用較小。重要的是，由于溫度迅速上升，PFP 轉變?yōu)闅馀菰鰪姵暢上?。同時，納米顆粒釋放出MnCl2，其體積小，可以更好地穿透腫瘤，獲得更均勻的磁共振成像結果。通過一系列的表征，證實PMINPs具有良好的腫瘤吸收能力，可用于乳腺癌超聲/磁共振雙模成像及治療。在以后的研究工作中，還有以下幾個方面的工作需要完善：可嘗試在納米微球表面修飾靶向物如適配體，葉酸等，增加其靶向性；進一步研究納米微球在動物體內(nèi)的成像與治療效果等，為臨床應用奠定試驗基礎。