孫維棟 余醒醒 安依涵 王鑫 王瑩 童向民

活性氧（reactive oxygen species,ROS）是一類(lèi)由氧形成，并在分子組成上含有氧，化學(xué)性質(zhì)比氧自身活潑的氧原子或原子團(tuán)[1]，在機(jī)體內(nèi)不斷產(chǎn)生及清除的過(guò)程中依然保持氧化-還原系統(tǒng)的穩(wěn)定，并在人體整個(gè)生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)機(jī)體處于疾病狀態(tài)或受到外源性物質(zhì)刺激后，這種動(dòng)態(tài)平衡可能被打破，如ROS的產(chǎn)生增多或抗氧化酶的減少（即ROS過(guò)剩），觸發(fā)細(xì)胞多個(gè)促凋亡通路[2]，對(duì)細(xì)胞造成傷害，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。癌細(xì)胞因?yàn)橄鄬?duì)正常細(xì)胞存在致癌刺激、代謝功能增加和線粒體功能障礙[3]，能產(chǎn)生較高水平的ROS。但在持續(xù)的氧化應(yīng)激下，癌細(xì)胞通過(guò)一系列機(jī)制能很好地適應(yīng)這種壓力，不僅可以激活ROS清除系統(tǒng)，還可以抑制細(xì)胞凋亡[4]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的鐵可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的ROS，給細(xì)胞帶來(lái)致命性損傷[5]。鐵進(jìn)入細(xì)胞后，被轉(zhuǎn)運(yùn)入線粒體，或儲(chǔ)存在鐵蛋白中[6]。鐵在線粒體中被用于合成鐵硫簇和血紅素。而合成血紅素的最后一步是二價(jià)鐵離子嵌入原卟啉Ⅸ，需要亞鐵螯合酶（ferrochelatase,FECH）催化。FECH能夠與ATP結(jié)合盒膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 10（ATP-binding-cassette B 10,ABCB10）以及線粒體轉(zhuǎn)鐵蛋白-1（mitoferrin-1,MFRN1）構(gòu)成一個(gè)位于線粒體內(nèi)膜的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體，參與把鐵從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入線粒體的過(guò)程[7]?；诖耍狙芯窟\(yùn)用短發(fā)夾（shRNA）在體外敲減人多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞中FECH的mRNA表達(dá)，阻斷原卟啉Ⅸ轉(zhuǎn)化為血紅素，改變細(xì)胞內(nèi)鐵的水平，探討FECH對(duì)RPMI8226細(xì)胞ROS產(chǎn)生及對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響和作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 RPMI l640培養(yǎng)基、FBS購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素購(gòu)自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，嘌呤霉素購(gòu)自北京凱瑞基生物科技有限公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技研究所，二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）購(gòu)自天津?yàn)I韻科技公司，無(wú)RIPA裂解液購(gòu)自上海碧云天生物科技研究所，SDS-聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購(gòu)自美國(guó) Millipore公司，一抗 FECH（1∶1 000）、鐵調(diào)節(jié)蛋白 2（iron regulatory protein2,IRP2）（1∶1 000）、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 1（transferrin receptor1,TfR1）（1∶1 000）、過(guò)氧化氫酶（Catalases）（1∶2 000）、β-Actin（1∶6 000）均購(gòu)自美國(guó)賽信通公司，兔抗鼠二抗（1∶5 000）購(gòu)自上海碧云天生物科技研究所，顯影劑購(gòu)自七海生物科技公司，血清RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器有限公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)艾森生物有限公司，雙色紅外激光掃描成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)LI-COR公司，Gel-Pro-Analyzer軟件為美國(guó)貝塞斯達(dá)軟件公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) RPMI8226細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)，293T細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，常規(guī)培養(yǎng)于含 10% FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃、含5% CO2和95%空氣的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 FECH shRNA的設(shè)計(jì)、合成和轉(zhuǎn)染 根據(jù)FECH基因序列設(shè)計(jì)靶向FECH序列的FECH shRNA 5'-CCCAAGGGTAATAAACGTGTA-3'，將 FECH shRNA 和空載對(duì)照ctrl shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后慢病毒液用0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾并用于轉(zhuǎn)染。RPMI8226細(xì)胞在24孔板轉(zhuǎn)染后在37℃溫育24 h后用嘌呤霉素（10 mg/ml）逐步篩選，后采用Western blot驗(yàn)證。

1.4 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 采用CCK-8法。分別將FECH shRNA和空載對(duì)照ctrl shRNA轉(zhuǎn)染后的RPMI8226細(xì)胞接種在96孔板中（4×103細(xì)胞/孔），用含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)養(yǎng)液在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培育，分別在 24、36、48、60、72、84、96 h 后加 CCK-8 10 μl，2 h后在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定吸光度，測(cè)定結(jié)果用生長(zhǎng)曲線描述細(xì)胞增殖情況。

1.5 細(xì)胞ROS測(cè)定 分別將FECH shRNA和空載對(duì)照ctrl shRN轉(zhuǎn)染后的RPMI8226細(xì)胞以每孔200×104細(xì)胞接種到6孔板，培育8 h后，收細(xì)胞PBS洗滌后在1.5 ml EP管內(nèi)加入無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液500μl，再加入2μmol/L二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA），在37℃黑暗環(huán)境中溫育20 min，吹打混勻后在流式細(xì)胞儀中測(cè)定ROS（激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm）。

1.6 細(xì)胞鐵代謝和抗氧化蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法。分別將FECH shRNA和空載對(duì)照ctrl shRNA轉(zhuǎn)染后的RPMI8226細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后，提取細(xì)胞至1.5 ml EP管，加入加酶抑制劑的RIPA裂解液冰上靜置 10 min使細(xì)胞充分裂解，12 000 r/min離心10 min，取上清液提取總蛋白，并將濃度調(diào)至同一濃度。配SDS-聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）上樣10 ul電泳，然后轉(zhuǎn)膜到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后，孵育一抗 FECH（1∶1 000）、IRP2（1∶1 000）、TfR1（1∶1 000）、Catalases（1∶2 000）、β-Actin（1∶6 000），在 4 ℃過(guò)夜，隨后與其相應(yīng)的二抗（1∶5 000）孵育 1 h，用顯影劑和Gel-Pro-Analyzer軟件來(lái)顯影和測(cè)量相對(duì)強(qiáng)度。以β-Actin作為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FECH敲減RPMI8226細(xì)胞的構(gòu)建驗(yàn)證 分別將FECH shRNA和空載對(duì)照ctrl shRNA轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞，Western blot驗(yàn)證顯示FECH敲減RPMI8226細(xì)胞構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1。

圖1 亞鐵螯合酶（FECH）shRNA和空載對(duì)照ctrl shRNA轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞后FECH表達(dá)電泳圖

2.2 FECH shRNA RPMI8226細(xì)胞和ctrl shRNA RPMI8226 細(xì)胞增殖能力比較 培育 24、36、48、60、72、84、96 h時(shí)，F(xiàn)ECH shRNA RPMI8226細(xì)胞吸光度均低于ctrl shRNA RPMI8226細(xì)胞（均 P＜0.05），即增殖能力較ctrl shRNA RPMI8226細(xì)胞減弱，生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 亞鐵螯合酶（FECH）shRNA RPMI8226細(xì)胞和ctrl shRNA RPMI8226細(xì)胞生長(zhǎng)曲線比較

2.3 FECH shRNA RPMI8226細(xì)胞和ctrl shRNA RPMI8226細(xì)胞ROS產(chǎn)生情況比較 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，相對(duì)ctrl shRNA RPMI8226細(xì)胞，F(xiàn)ECH shRNA RPMI8226細(xì)胞 ROS產(chǎn)生增加（1.52±0.8）倍。

2.4 FECH shRNA RPMI8226細(xì)胞和 ctrl shRNA RPMI8226細(xì)胞 IRP2、TfR1、Catalases表達(dá)情況比較 與ctrl shRNA RPMI8226 細(xì)胞相比，F(xiàn)ECH shRNA RPMI8226細(xì)胞IRP2、TfR1表達(dá)上調(diào)，Catalases表達(dá)下調(diào)，見(jiàn)圖3。

圖3 亞鐵螯合酶（FECH）shRNA RPMI8226細(xì)胞和ctrl shRNA RPMI8226 細(xì)胞鐵調(diào)節(jié)蛋白 2（IRP2）、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 1（TfR1）、過(guò)氧化氫酶（Catalases）表達(dá)情況比較（a為蛋白表達(dá)電泳圖；b、c、d分別為IRP2、TfR1、Catalase相對(duì)表達(dá)水平比較）

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是發(fā)生于B細(xì)胞終末分化階段的惡性疾病，是惡性漿細(xì)胞在骨髓內(nèi)異常增生，伴有單克隆免疫球蛋白或輕鏈（M蛋白）過(guò)度生成，常合并多發(fā)性溶骨性損害、高鈣血癥、貧血、腎臟損害，引起骨折、骨髓功能衰竭及腎臟疾病，產(chǎn)生一系列臨床癥狀[8]。不進(jìn)行治療的進(jìn)展期多發(fā)性骨髓瘤患者中位生存期僅有6個(gè)月，而接受傳統(tǒng)化療的中位生存期也不超過(guò)3年，僅有25%患者的生存期在5年以上[9]。近幾年來(lái)，新的治療藥物，如來(lái)那度胺和硼替佐米已用于多發(fā)性骨髓瘤的治療，盡管目前治療有了更好的臨床效果，但還有不少患者最終死于復(fù)發(fā)和難治性疾病，因此需要新的治療靶點(diǎn)和藥物來(lái)延長(zhǎng)復(fù)發(fā)時(shí)間或更有效地達(dá)到治療目標(biāo)。ROS在機(jī)體的免疫過(guò)程和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)活性氧過(guò)多積聚，超過(guò)抗氧化酶系統(tǒng)的清除能力，就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)損傷細(xì)胞膜、引起蛋白質(zhì)變性、酶活性喪失等損害作用[10]。

本研究運(yùn)用shRNA技術(shù)抑制RPMI8226細(xì)胞的FECH表達(dá)。通過(guò)敲減RPMI8226細(xì)胞的FECH，研究其引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化的機(jī)制及其對(duì)癌細(xì)胞增殖的影響，從而為多發(fā)性骨髓瘤臨床治療提供新的突破口和治療靶點(diǎn)。細(xì)胞質(zhì)中鐵調(diào)節(jié)蛋白（iron regulatory proteins,IRPs）監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)鐵水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存蛋白的合成和表達(dá)[11]。RPMI8226細(xì)胞的FECH敲減后，線粒體內(nèi)血紅素合成障礙，線粒體向細(xì)胞質(zhì)傳遞了持續(xù)輸入鐵的信號(hào)以恢復(fù)血紅素的正常合成，引起IRP2表達(dá)上調(diào)。IRP2表達(dá)上調(diào)后，IRP2與調(diào)節(jié)鐵反應(yīng)元件（iron responsive elements,IREs）結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上促進(jìn)了TfR1的表達(dá)與合成[12]。細(xì)胞內(nèi)TfR1的表達(dá)上調(diào)，與血液中的轉(zhuǎn)運(yùn)亞鐵離子的轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin,Tf）結(jié)合，促進(jìn)了亞鐵離子轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)[13]。而細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子累積，通過(guò)Fenton和Haber-Weiss-like反應(yīng)產(chǎn)生ROS[14]。細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增多，造成細(xì)胞毒性[11]。同時(shí)細(xì)細(xì)胞內(nèi)Catalases蛋白水平下降，清除H2O2能力下降[15]，使ROS降解減少，細(xì)胞內(nèi)ROS過(guò)剩，細(xì)胞抗氧化能力下降，增加了細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，造成細(xì)胞功能損傷。因此，F(xiàn)ECH敲減后的RPMI8226細(xì)胞因鐵積累后ROS產(chǎn)生增多，同時(shí)抗氧化酶減少降低了ROS的降解，打破了細(xì)胞內(nèi)氧化-還原系統(tǒng)的平衡，使細(xì)胞內(nèi)ROS明顯增多，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，增加了對(duì)細(xì)胞的毒性[16]，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力下降。

綜上所述，F(xiàn)ECH對(duì)維持RPMI8226細(xì)胞氧化還原的動(dòng)態(tài)平衡起重要作用。FECH表達(dá)受抑制后，RPMI8226細(xì)胞IRP2、TfR1表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞內(nèi)鐵過(guò)載，ROS產(chǎn)生增多，同時(shí)抗氧化蛋白Catalases表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞抗氧化能力下降，引發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激，抑制細(xì)胞增殖。