韓芳芳，孫鑫，沈志強(qiáng)

(黃河水利委員會(huì)黃河中心醫(yī)院 病理科，河南 鄭州 450000)

宮頸癌為女性常見惡性腫瘤，近年隨著醫(yī)學(xué)篩查技術(shù)發(fā)展及人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)預(yù)防性疫苗的應(yīng)用，宮頸癌發(fā)病率有所降低，但呈現(xiàn)年輕化趨勢[1-2]。目前臨床治療宮頸癌主要以手術(shù)或放化療方案為主，但患者預(yù)后不夠理想。因此，尋找特異性腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物對完善治療方案具有重要意義。哺乳動(dòng)物不育系20樣激酶1(mammalian sterile 20-like kinase 1，Mst1)為Hippo信號通路的核心成員之一，廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，可調(diào)節(jié)胚胎生長發(fā)育，抑制腫瘤生長，影響細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。已有研究發(fā)現(xiàn)，Mst1在口腔鱗癌、乳腺癌、鼻咽癌、胃癌等多種惡性腫瘤中呈異常低表達(dá)，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[3-6]。本研究選取2011年1月至2019年12月黃河水利委員會(huì)黃河中心醫(yī)院收治的80例宮頸癌患者作為研究對象，分析Mst1表達(dá)水平與宮頸癌相關(guān)病理學(xué)參數(shù)的關(guān)聯(lián)性，為宮頸癌的治療提供新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2011年1月至2019年12月黃河水利委員會(huì)黃河中心醫(yī)院收治的80例宮頸癌患者作為研究對象，均經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)，手術(shù)治療時(shí)均取宮頸癌組織及配對癌旁組織(距腫瘤邊緣≥4 cm處)為標(biāo)本，術(shù)前未進(jìn)行放療或化療，離體后立即置入液氮中保存，排除蘇木精-伊紅染色制作過程中出現(xiàn)掉片、滑片現(xiàn)象的病例。

1.2 研究方法

1.2.1免疫組化法 宮頸癌組織及癌旁組織標(biāo)本以體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定，石蠟切片，采用免疫組化SP法檢測，兔抗人Mst1單克隆抗體按照1∶100稀釋。用磷酸鹽緩沖液替代一抗進(jìn)行陰性對照，已知陽性組織片為陽性對照組。兔抗人Mst1單克隆抗體由CST公司提供，免疫組化試劑盒由武漢博士德生物公司提供。根據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)度判定結(jié)果：棕黃色或黃褐色為2分，淺黃色為1分，無著色為0分。組織染色后細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為Mst1陽性，40倍顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，根據(jù)Mst1陽性表達(dá)細(xì)胞率評定，>75%為4分，51%～75%為3分，26%～<51%為2分，<26%為1分。最終得分為細(xì)胞著色得分和染色強(qiáng)度得分乘積，>4分為陽性，≤4分為陰性。

1.2.2Western blot法 取宮頸癌組織、癌旁組織，以NP-40裂解液冰上裂解30 min，期間每隔5 min震蕩1次，以促進(jìn)裂解，4 ℃下離心(時(shí)間15 min，轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1)，提取蛋白，以BCA法進(jìn)行蛋白定量，取40 μg上樣行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜(120 mA恒流轉(zhuǎn)膜)，以50 g·L-1的牛血清白蛋白室溫封閉2 h，一抗Mst1(1∶500)及β-actin(1∶1 000)于4 ℃下過夜，次日用TBST洗膜，二抗(1∶5 000)于37 ℃環(huán)境中溫育1 h，用TBST洗膜后以化學(xué)發(fā)光法顯影檢測。鼠抗人β-actin單克隆抗體及二抗均由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，蛋白抽提試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑盒及蛋白水平檢測試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。經(jīng)灰度掃描儀分析獲得各條帶灰度值。以宮頸癌組織Mst1條帶灰度值與對應(yīng)的β-actin灰度值之比表示Mst1在宮頸癌組織中的表達(dá)量。

1.3 觀察指標(biāo)(1)宮頸癌組織及癌旁組織Mst1表達(dá)水平。(2)不同病理參數(shù)(年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分型、分化程度、FIGO分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)Mst1陽性表達(dá)率。(3)采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析Mst1陽性表達(dá)率與FIGO分期的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織及癌旁組織Mst1表達(dá)水平宮頸癌組織Mst1表達(dá)水平(0.64±0.09)較癌旁組織(1.05±0.10)低，陽性表達(dá)率[27.50%(22/80)]較癌旁組織[80.00%(64/80)]低(P<0.05)。

2.2 宮頸癌不同病理學(xué)參數(shù)Mst1陽性表達(dá)率不同年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分型、分化程度宮頸癌患者M(jìn)st1陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；FIGO分期為ⅡB～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者M(jìn)st1陽性表達(dá)率低于FIGO分期為ⅠB～ⅡA期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者(P<0.05)。見表1。

表1 宮頸癌不同病理學(xué)參數(shù)Mst1陽性表達(dá)情況 比較[n(%)]

2.3 Mst1陽性表達(dá)率與FIGO分期的相關(guān)性Spearman相關(guān)系數(shù)分析顯示，Mst1陽性表達(dá)率與FIGO分期呈負(fù)相關(guān)(r=-0.601，P=0.012)。

3 討論

相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，早期宮頸癌5 a生存率能達(dá)91.5%，局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者5 a生存率下降至57.1%，但遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者5 a生存率僅為17.3%，可見轉(zhuǎn)移是影響患者生存的重要因素[7-8]。因此，明確腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的病理生理機(jī)制，對延長患者生存期尤為重要。

Hippo信號通路是一種抑癌通路，由多種抑癌基因及1種候選癌基因YAP組成，可維持細(xì)胞增殖與凋亡平衡，其中Mst1為其核心分子。Mst1被激活后進(jìn)入細(xì)胞核，激活促凋亡的組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子，抑制細(xì)胞生長，Mst1缺失時(shí)會(huì)抑制細(xì)胞凋亡。王淑麗等[9]研究表明，Mst1在宮頸癌中呈低表達(dá)，可作為宮頸癌臨床治療和預(yù)后判斷新的靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織Mst1表達(dá)水平、陽性表達(dá)率均低于癌旁組織，與上述研究結(jié)果相似，說明Mst1可能參與宮頸癌的發(fā)病。Mst1可通過磷酸化調(diào)節(jié)Hippo-YAP信號傳導(dǎo)途徑中的核心激酶反應(yīng)鏈其余部分，參與細(xì)胞凋亡，使組織器官處于動(dòng)態(tài)平衡，但外界刺激會(huì)導(dǎo)致Mst1磷酸化活性減弱，致使細(xì)胞凋亡減少或增殖過度，引發(fā)惡性腫瘤。鄭小影等[10]以蟲草素處理宮頸癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，Hippo信號通路的關(guān)鍵蛋白Mst1表達(dá)上調(diào)，從而抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。李華等[11]研究證實(shí)，牛磺酸通過上調(diào)Mst1表達(dá)引起B(yǎng)ax蛋白表達(dá)上調(diào)和Bcl-2蛋白下調(diào)，誘導(dǎo)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡，從而對宮頸癌發(fā)揮治療效果。本研究中FIGO分期為ⅡB～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者M(jìn)st1陽性表達(dá)率低于FIGO分期為ⅠB～ⅡA期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者，進(jìn)行Spearman相關(guān)系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，Mst1陽性表達(dá)率與FIGO分期呈負(fù)相關(guān)，可見Mst1與宮頸癌的增殖、轉(zhuǎn)移等有關(guān)，參與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展，可能是由于Mst1表達(dá)水平降低，使機(jī)體降低或失去對宮頸癌的抑制作用。因此，可考慮將上調(diào)Mst1表達(dá)作為治療宮頸癌的新途徑。

綜上可知，Mst1在宮頸癌中呈異常低表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展，可作為評估宮頸癌病情程度的重要指標(biāo)，為臨床診治提供參考依據(jù)。