劉娟 馬藝珈 王舒 路暢 楊陽 蔡春波 趙燕 郭曉紅 曹果清 李步高 高鵬飛

摘? 要：肌內(nèi)脂肪含量及脂肪酸組成是影響豬肉品質(zhì)的重要因素，本研究旨在從基因表達(dá)水平分析相關(guān)關(guān)鍵基因的表達(dá)特征。本研究以大白豬和馬身豬為研究對象，采用qRT-PCR技術(shù)檢測ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7、NDUFV1和PSTPIP2在不同日齡以及不同組織中的表達(dá)規(guī)律，采用MEGA7.0軟件進(jìn)行物種進(jìn)化樹分析。結(jié)果顯示，6個(gè)基因在不同日齡的馬身豬和大白豬上均有表達(dá)，但隨著日齡增長，基因的表達(dá)趨勢不同。在馬身豬中，ATP5A1、NDUFAB1、CPOX和NDUFB7的表達(dá)量均隨著日齡增長逐漸降低，PSTPIP2表達(dá)量隨著日齡增長出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，NDUFV1表達(dá)量隨著日齡增長沒有顯著變化。在大白豬中，ATP5A1和 NDUFV1表達(dá)量隨著日齡增長逐漸降低，NDUFAB1、CPOX和NDUFB7隨著日齡增長出現(xiàn)先降低后升高的趨勢，而PSTPIP2表達(dá)量隨著日齡增長逐漸升高。組織表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，6個(gè)基因在脂肪的相對表達(dá)量極顯著高于其他組織，另外，其在7種組織的相對表達(dá)量趨勢不同。親緣關(guān)系與進(jìn)化樹分析顯示，6個(gè)基因在進(jìn)化過程中比較保守。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步探討豬肌肉脂肪酸代謝作用機(jī)制提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬;肌內(nèi)脂肪;脂肪酸;表達(dá)分析

中圖分類號：S813 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-0769（2021）02-0031-06

隨著生活和消費(fèi)水平的提高，營養(yǎng)、綠色的肉品成為人們新的追求[1]。這對養(yǎng)殖業(yè)提出新的挑戰(zhàn)，風(fēng)味獨(dú)特、瘦肉率高、脂肪含量低、嫩度高等成為肉質(zhì)研究的主題。肌內(nèi)脂肪是形成肉質(zhì)風(fēng)味的重要物質(zhì)，其脂肪酸組成影響著肉類營養(yǎng)和感官品質(zhì)指標(biāo)[2]。單不飽和脂肪酸的氧化穩(wěn)定性比多不飽和脂肪酸強(qiáng)，能使肉的口感和色澤更好[3]，而多不飽和脂肪酸可以降低人們患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[4]。因此，為了提高豬肉品質(zhì)，研究出人們追求的綠色豬肉，了解脂肪酸代謝機(jī)制非常必要。

脂肪酸代謝機(jī)制一直是國內(nèi)外科學(xué)家的研究熱點(diǎn)。研究表明過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome Proliferators-activated Receptors γ，PPARγ）和核呼吸因子-1（Nuclear Respiratory Factor-1，NRF-1）或核呼吸因子-2（Nuclear Respiratory Factor-2，NRF-2）能夠提高骨骼肌中脂肪酸引起的解偶聯(lián)蛋白1 （Uncoupling Protein 1，UCP1）的轉(zhuǎn)錄[5]。研究發(fā)現(xiàn)長鏈?；o酶A合成酶1（Acyl-CoA Synthetase 1，ACSL1）作為線粒體內(nèi)脂肪酸氧化代謝的關(guān)鍵酶，能分解棕色脂肪細(xì)胞中的甘油三酯，產(chǎn)生的脂肪酸在酰基輔酶A的作用下進(jìn)入線粒體內(nèi)氧化，激活細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸代謝，同時(shí)調(diào)節(jié)脂肪酸攝取[6]，增加油酸的攝入，提高不飽和脂肪酸的沉積量[7-8]。Lourdes等發(fā)現(xiàn)胰島素生長因子2（Insulin Growth Factor 2，IGF2）在不同豬品種間存在g.3072G>A突變，突變后該基因表達(dá)增加，導(dǎo)致多不飽和脂肪酸升高，單不飽和脂肪酸降低，從而影響脂肪酸組成[9]。Dragos等以硬脂酰輔酶A去飽和酶1 （Stearoyl-CoA Desaturase 1，SCD1）基因敲除小鼠為研究對象，分析SCD1在脂肪酸代謝過程中的作用，發(fā)現(xiàn)SCD1能夠減少小鼠白色脂肪組織中脂肪酸再酯化，影響甘油生成和脂肪分解[10]。肝臟型肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1（Carnitine Palmitoyl Transferase 1，CPT1A）是長鏈脂肪酸β氧化的限速酶，可以催化長鏈脂肪酸從酰基輔酶A轉(zhuǎn)化為?；舛緣A，使長鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體內(nèi)氧化[11]，加速脂肪酸分解，減少體內(nèi)脂肪含量[12]。

研究團(tuán)隊(duì)前期分析發(fā)現(xiàn)ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7、NDUFV1和PSTPIP2在豬脂肪酸代謝中具有重要作用[13]。本研究以大白豬和馬身豬為研究對象，利用qRT-PCR技術(shù)分析6個(gè)基因在豬肌肉發(fā)育過程中的表達(dá)變化及組織表達(dá)譜，基于這6個(gè)基因的氨基酸序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，初步分析這6個(gè)基因在豬脂肪酸代謝過程中的表達(dá)規(guī)律和作用，為豬脂肪酸代謝的相關(guān)研究提供參考。

1? 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品采集

于1日齡、30日齡、60日齡、90日齡、120日齡、150日齡和180日齡分別隨機(jī)選擇3頭體重相近的馬身豬和大白豬，采集心、肝、脾、腎、脂肪、小腸、背最長肌和股二頭肌，于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2主要試劑

TRIzol Reagent （Life Technologies公司）;PrimeScriptTM RT reagent Κit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司）;乙醇、氯仿、異丙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)和合成

參考GenBank數(shù)據(jù)庫中豬ATP5A1? ? ? ? ? ? ? ? ? （NM_001185142.1）、NDUFAB1 （NM_001167652.1）、CPOX（NM_001243844.1）、NDUFB7（XM_003480775.4）、NDUFV1? ? ? ? ? ? ? ? ?（XM_003122438.5）、PSTPIP2? （XM_021092533.1）和18S rRNA （NW_018085108.1）序列，其中18S rRNA為內(nèi)參基因。使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

1.2.2總RNA提取和cDNA合成

TRIzol Reagent提取總RNA后，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，用核酸蛋白測定儀（ND-2000，Nanodrop，USA）測定總RNA的純度和濃度。將得到的RNA通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存。

1.2.3 qRT-PCR檢測基因表達(dá)

采用qRT-PCR檢測6個(gè)基因表達(dá)，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)程序如下：預(yù)變性階段，95 ℃ 30 s;循環(huán)階段，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán);溶解階段，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s。

1.2.4系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//plants.ensembl.org/index.html）獲取9個(gè)物種（豬、山羊、牛、人、獼猴、雞、綠頭鴨、大鼠、小鼠）ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7、NDUFV1和PSTPIP2的氨基酸序列。使用Clustal W 2.0 （http：//www.clustal.org/clustal2/）[14]將6個(gè)基因的氨基酸序列進(jìn)行比對。利用MEGA 7.0（https：//www.megasoftware.net/）的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，使用Bootstrap法進(jìn)行1 000次可信度檢測。

1.2.5統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行基因表達(dá)差異分析，采用t檢驗(yàn)分析基因在不同日齡間的表達(dá)差異，單因素方差分析基因在不同組織中的表達(dá)差異，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2? 結(jié)果

2.1 基因在不同日齡的表達(dá)分析

在馬身豬中，ATP5A1、NDUFAB1、CPOX和NDUFB7在1日齡表達(dá)量最高，90日齡表達(dá)量逐漸降低;NDUFV1和PSTPIP2在1日齡表達(dá)量最低，NDUFV1在180日齡表達(dá)量最高，PSTPIP2在120日齡表達(dá)量最高，180日齡有降低的趨勢。在大白豬中，ATP5A1和 NDUFV1在1日齡時(shí)表達(dá)量最高，然后逐漸降低，180日齡表達(dá)量最低;NDUFAB1、CPOX和NDUFB7在1日齡表達(dá)量最高，90日齡表達(dá)量最低，180日齡表達(dá)量有升高趨勢;PSTPIP2在1日齡表達(dá)量最低，隨著日齡增長表達(dá)量逐漸升高，180日齡表達(dá)量最高。見圖1。

兩品種間比較發(fā)現(xiàn)，大白豬ATP5A1的表達(dá)量在30日齡和60日齡顯著高于馬身豬，在120日齡、150日齡和180日齡極顯著低于馬身豬;馬身豬NDUFAB1的表達(dá)量在30日齡顯著高于大白豬，在120日齡、150日齡和180日齡極顯著低于大白豬;大白豬CPOX和NDUFB7的表達(dá)量在120日齡、150日齡和 180日齡極顯著高于馬身豬;NDUFV1的表達(dá)量在各個(gè)日齡（不包括90日齡）均有差異，大白豬在1日齡、30日齡和60日齡較高，馬身豬在120日齡、150日齡和180日齡較高;大白豬PSTPIP2的表達(dá)量在60日齡、120日齡和180日齡顯著高于馬身豬，在150日齡極顯著高于馬身豬。

2.2 基因在不同組織的表達(dá)分析

6個(gè)基因在馬身豬不同組織中均有表達(dá)，在脂肪中的表達(dá)量均極顯著高于其他組織。ATP5A1、NDUFV1、NDUFAB1和NDUFB7在肝和脾中的表達(dá)量僅次于脂肪，接下來是小腸、腎和肌肉，在心臟中的表達(dá)量最低;CPOX在肌肉中的表達(dá)量僅次于脂肪，接下來是脾、心、小腸和腎，在肝中的表達(dá)量最低;PSTPIP2在肝、腎、心臟中的表達(dá)量極顯著低于脂肪，脾臟中的表達(dá)量極顯著低于肌肉。見圖2。

2.3 豬與其他物種進(jìn)化樹的構(gòu)建

將豬6個(gè)基因的氨基酸序列與其他物種比較發(fā)現(xiàn)（表2），6個(gè)基因均較保守，豬與山羊、牛的同源性最高，為99.95%，與人的同源性為99.94%，與獼猴的同源性為99.93%，與雞和綠頭鴨的同源性最低，為99.8%。

根據(jù)6個(gè)基因氨基酸序列在不同物種之間的同源性比較結(jié)果構(gòu)建進(jìn)化樹。如圖3顯示， 聚類數(shù)主要分為4個(gè)分支，其中山羊和牛組成反芻動(dòng)物分支，再和豬聚在一起，人和獼猴組成靈長類分支，大鼠和小鼠組成嚙齒類動(dòng)物分支，最后雞和綠頭鴨組成禽類分支。禽類分支與其他分支距離最遠(yuǎn)。豬6個(gè)基因的氨基酸序列與牛和山羊的親緣關(guān)系較近，其次是人和獼猴，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是綠頭鴨和雞。

3? 討論

肌內(nèi)脂肪含量和脂肪酸組成可直接影響豬肉品質(zhì)，尤其是肉的風(fēng)味、嫩度、多汁性和營養(yǎng)價(jià)值。脂肪酸是肌內(nèi)脂肪的物質(zhì)前提，肉質(zhì)是脂肪酸和肌內(nèi)脂肪的體現(xiàn)。在脂肪酸中，飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸有較好的感官特性和工藝特性，主要影響肉質(zhì)風(fēng)味，而多不飽和脂肪酸具有較好的營養(yǎng)特性，影響肉質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值[15]。油酸（C18∶1）是豬肉中含量最豐富的脂肪酸，可以作為改善豬肉感官和營養(yǎng)特性的重要指標(biāo)[16]。

研究團(tuán)隊(duì)根據(jù)前期的轉(zhuǎn)錄組測序分析獲得了一系列影響肌肉中脂肪酸代謝的基因，其中ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7、NDUFV1和PSTPIP2在不同類型豬肌內(nèi)脂肪中的表達(dá)量差異最顯著[13]。ATP5A1是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，經(jīng)常用作線粒體復(fù)合物的標(biāo)記。線粒體中的二肽重復(fù)蛋白Poly（GR）通過泛素-蛋白酶體途徑增加了ATP5A1的泛素化及其降解[17]。楊素麗等利用免疫組化方法檢測發(fā)現(xiàn)大腸癌中的ATP5A1比相應(yīng)癌旁組織的明顯上調(diào)[18]。其他研究還驗(yàn)證了ATP5A1在腫瘤發(fā)病機(jī)制中起重要作用，可能通過調(diào)節(jié)腫瘤磷酸化與人類透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的發(fā)展相關(guān)聯(lián)[19]。NDUFAB1作為線粒體代謝的新型增強(qiáng)劑，通過協(xié)同增強(qiáng)線粒體脂肪酸合成途徑介導(dǎo)脂酰化和丙酮酸脫氫酶的活化，增加呼吸復(fù)合體和超復(fù)合體的組裝，防止脂肪沉積過高而導(dǎo)致肥胖和胰島素抵抗[20]。CPOX蛋白包含許多還原的硫醇?xì)埢?，可催化血紅素生物合成途徑中的卟啉原-Ⅲ向原卟啉原-Ⅸ的兩步脫羧反應(yīng)，CPOX4缺失可導(dǎo)致血紅素生物合成受損[21]。NDUFB7位于泛醌氧化還原酶復(fù)合物Ⅰ的膜間表面[22]，在線粒體活動(dòng)供能方面起重要作用。NDUFV1和NDUFV2是涉及氧化應(yīng)激和ATP產(chǎn)生的兩個(gè)重要亞基[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，NDUFV1可為母豬腹中胎兒發(fā)育提供能量[24]。PSTPIP2是一種與自身炎性疾病相關(guān)的蛋白，它參與巨噬細(xì)胞的活化、嗜中性粒細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和破骨細(xì)胞的分化等[25]。

Linn等對來自95個(gè)人的27個(gè)不同組織樣本進(jìn)行RNA測序發(fā)現(xiàn)，ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7在心臟、腎、脂肪等組織中均有表達(dá)，其中ATP5A1、NDUFAB1在心臟中的表達(dá)量最高，CPOX在骨髓中的表達(dá)量最高，NDUFB7在脂肪中的表達(dá)量最高[26]。本研究中，ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7在兩個(gè)品種豬的不同日齡均有表達(dá)，且隨著日齡增長表達(dá)量逐漸降低，在發(fā)育初期表達(dá)量較高。ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7在脂肪中的相對表達(dá)量極顯著高于其他組織，表明4個(gè)基因可能在豬發(fā)育初期的脂肪酸代謝過程中有重要作用，可為仔豬生長發(fā)育提供能量。Linn等發(fā)現(xiàn)，NDUFV1在人類25個(gè)組織中均有表達(dá)，在心臟中表達(dá)量最高[26]。本研究中，NDUFV1在脂肪中的相對表達(dá)量極顯著高于其他組織，表明在豬的發(fā)育過程中NDUFV1能夠促進(jìn)脂肪沉積。PSTPIP2在人類17個(gè)組織中均有表達(dá)，其中在骨髓中的表達(dá)量最高[26]。本研究也發(fā)現(xiàn)PSTPIP2在脂肪中的相對表達(dá)量最高，提示PSTPIP2可能在豬的發(fā)育后期對脂肪沉積起作用。

本研究對影響豬肌內(nèi)脂肪沉積與脂肪酸組成關(guān)鍵基因的表達(dá)特征進(jìn)行分析，初步證明這些基因通過影響肌肉中脂肪酸的合成代謝可為機(jī)體提供能量，進(jìn)而影響豬肉品質(zhì)。本研究結(jié)果可為深入研究豬脂肪酸代謝機(jī)制提供理論依據(jù)，為探索豬脂肪酸對肉質(zhì)性狀影響提供參考。

參考文獻(xiàn)：（26篇，略）