周貽兵，李磊，吳玉田，劉利亞*

貴州省疾病預(yù)防控制中心（貴陽 550004）

真菌毒素是農(nóng)產(chǎn)品的主要污染物質(zhì)之一，且隨著氣候變化，產(chǎn)毒真菌譜及真菌毒素發(fā)生顯著變化，新興真菌毒素不斷被發(fā)現(xiàn)，成為世界各國高度關(guān)注的食品安全熱點(diǎn)問題[1]。新興真菌毒素白僵菌素（BEA）和恩鐮孢菌素B（ENB）是由鐮刀菌屬真菌侵染小麥、玉米等農(nóng)作物后，在潮濕和低溫條件下產(chǎn)生的環(huán)狀六縮酚酸肽類真菌毒素[2-3]。BEA和ENB能提高陽離子穿過細(xì)胞膜能力，由此干擾正常生理水平下細(xì)胞的陽離子水平、影響細(xì)胞膜的電化學(xué)梯度，而產(chǎn)生細(xì)胞毒性、免疫毒性、血液等方面毒性[4-5]。國內(nèi)并無2種新興毒素檢測國家標(biāo)準(zhǔn)，給農(nóng)產(chǎn)品中BEA和ENB污染狀況調(diào)查帶來難度，因此，建立小麥粉中BEA和ENB準(zhǔn)確、可操作性強(qiáng)的檢測方法為農(nóng)產(chǎn)品檢測提供參考。

農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素常使用混合溶劑提取，采用QuEChERS法、免疫親和柱、多功能凈化柱、固相萃取柱等凈化方法有效降低基質(zhì)影響，使用液相色譜或液相色譜質(zhì)譜法進(jìn)行檢測[6-14]。在綜合文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，結(jié)合面粉基質(zhì)干擾情況，采用PEP固相萃取柱凈化，對待凈化液、淋洗液中乙腈比例進(jìn)行優(yōu)化，建立UPLC-MS/MS檢測小麥粉中BEA和ENB這2種新興真菌毒素含量，為分析小麥粉中BEA和ENB這2種新興真菌毒素污染現(xiàn)狀提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000-TSQ Quantum Ultra超高壓液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）（美國Thermo公司）；3-18K臺式高速離心機(jī)（Sigma中國有限公司）；Milli-Q超純水機(jī)（美國密理博公司）；IKA MS3渦旋混均儀（德國IKA公司）；T 460 H型超聲波清洗器（北京博勵行儀器有限公司）。

乙腈、甲酸（色譜純，美國Thermo公司）；乙酸銨（LC-MS級，阿拉丁試劑上海有限公司）、氨水（優(yōu)級純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；PEP固相萃取柱（200 mg 6cc，美國Thermo公司）；MycoSep 226、MycoSep 227、MycoSep 228多功能凈化柱（Romer國際貿(mào)易有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為一級水；白僵菌素標(biāo)準(zhǔn)品和恩鐮飽菌素B標(biāo)準(zhǔn)品（青島普瑞邦生物工程有限公司）。

白僵菌素標(biāo)準(zhǔn)品貯備液（1 mg/mL）：取10 mg白僵菌素標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，備用。

白僵菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）：準(zhǔn)確吸取1.00 mL質(zhì)量濃度1 mg/mL白僵菌素標(biāo)準(zhǔn)貯備液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度100 μg/mL白僵菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

白僵菌素和恩鐮孢菌素B混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確吸取質(zhì)量濃度均為100 μg/mL白僵菌素和恩鐮飽菌素B標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL和0.50 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，備用。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm×1.7 μm，Waters公司）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積5 μL；流動相A為0.1%甲酸水溶液；流動相B為甲醇；梯度洗脫程序：0～0.5 min 95% A，0.5～7.5 min 95%的A線性變化為10%，7.5～11 min 10% A，11.1～14 min 95%A；流速0.3 mL/min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧（ESI+）離子源；噴霧電壓3 500 V；毛細(xì)管溫度300 ℃；蒸發(fā)溫度300 ℃；鞘氣壓力273 kPa；輔助氣102 kPa；碰撞氣0.2 Pa；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）優(yōu)化參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

1.3 樣品提取與凈化

準(zhǔn)確稱取5 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入30 mL乙腈-甲酸-水（體積比84︰1︰15）溶液，渦旋混勻，超聲提取30 min，渦旋提取1 min，以10 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移提取液于50 mL刻度離心管中，加入10 mL乙腈-甲酸-水（體積比84︰1︰15）溶液重復(fù)提取1次，離心，合并提取液，用乙腈-甲酸-水（體積比84︰1︰15）溶液定容至40 mL，混均，準(zhǔn)確吸取10 mL提取液于50 mL刻度離心管中，加入15 mL水稀釋，混均，待凈化。將樣品待凈化液經(jīng)6 mL甲醇和6 mL水活化后的PEP固相萃取柱凈化，3 mL乙腈-水溶液（體積比40︰60）淋洗并抽干固相萃取柱，用3 mL乙腈均分2次洗脫P(yáng)EP固相萃取柱，收集洗脫液，混均，渦旋混勻，過0.22 μm微孔濾膜，上機(jī)測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 監(jiān)測模式的選擇

BEA和ENB 2種新興真菌毒素分子式分別為C45H57N3O9和C33H57N3O9，相對分子質(zhì)量為783.4和639.4，BEA在N-甲基-氨基酸殘基上具有苯基，ENB在相同位置上具有異丙基，均為環(huán)狀六縮酚酸肽類結(jié)構(gòu)，在液質(zhì)中易于離子化。在甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相、0.3 mL/min流速條件下，以10 μL/min通過針泵將質(zhì)量濃度均為0.5 μg/mL BEA和ENB這2種新興真菌毒素注入質(zhì)譜儀器中，采用正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行全掃描，BEA和ENB均在ESI+模式下響應(yīng)信號遠(yuǎn)高于ESI-模式下響應(yīng)信號，所以選擇ESI+模式檢測2種新興真菌毒素。比較ESI+模式下BEA和ENB的[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+、[M+NH4]+的響應(yīng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BEA和ENB這2種真菌毒素[M+H]+響應(yīng)值＞[M+NH4]+響應(yīng)值＞[M+Na]+響應(yīng)值＞[M+K]+響應(yīng)值。同時，考察甲醇-5 mmol/L的醋酸銨水溶液為流動相條件下，BEA和ENB的響應(yīng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BEA的[M+H]+響應(yīng)值＞[M+NH4]+；ENB的[M+H]+響應(yīng)值＜[M+NH4]+響應(yīng)值，但[M+NH4]+與甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相條件下的[M+H]+響應(yīng)無顯著提高，且以[M+NH4]+為準(zhǔn)分子離子進(jìn)行碰碎，響應(yīng)高、穩(wěn)定的碎片離子為m/z640.7，196.0和214.1，而m/z640.7是ENB的[M+H]+離子之間相互串?dāng)_，影響定量，所以綜合考慮選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相，BEA和ENB這2種新興真菌毒素均以[M+H]+準(zhǔn)分子離子為母離子進(jìn)行碰碎，進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，選擇響應(yīng)較高、穩(wěn)定且干擾較小的2個碎片離子構(gòu)成監(jiān)測離子對，同時對透鏡電壓、碰撞能量等質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表1。

BEA和ENB這2種新興真菌毒素極性較弱，在反相C18色譜柱上保留較強(qiáng)，采用甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫，BEA和ENB標(biāo)準(zhǔn)的TIC圖譜見圖1。

2.2 樣品提取液的優(yōu)化

農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素常采用乙腈、甲醇、乙腈-水、甲醇-水、酸化乙腈、酸化甲醇、酸化乙腈-水和酸化的甲醇-水溶液提取。因?yàn)樾←湻壑械矸酆偷鞍椎冉M分在提取過程中易發(fā)生交聯(lián)而影響毒素提取效果，所以在提取過程中需加水浸泡展開提高提取效率。BEA和ENB極性弱，仍采用真菌毒素常用的提取溶劑乙腈-水（體積比84︰16）混合溶液提取2種新興毒素，同時比較含1%甲酸酸化的乙腈-水溶液與未酸化的乙腈-水溶液對2種新興毒素的提取回收率，結(jié)果表明，小麥粉中BEA采用含1%甲酸酸化的乙腈-水溶液提取回收率（76.25%～99.31%）略高于未酸化乙腈-水溶液的回收率（72.15%～98.93%），而ENB采用含1%甲酸酸化的乙腈-水溶液提取回收率（74.60%～91.17%）略低于未酸化乙腈-水溶液的回收率（76.85%～93.67%）；相同濃度下ENB的響應(yīng)高于BEA的響應(yīng)，為了2種新興毒素同時檢測，優(yōu)先滿足靈敏度低BEA響應(yīng)，綜合考慮選擇含1%甲酸酸化的乙腈-水溶液提取小麥粉中BEA和ENB這2種新興真菌毒素。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)的TIC圖譜

2.3 凈化方法、待凈化液、淋洗液中乙腈比例和洗脫液乙腈用量的優(yōu)化

小麥粉樣品基質(zhì)的存在影響B(tài)EA和ENB離子化效率，需采用一定凈化方法減小基質(zhì)的影響。真菌毒素常采用特異性強(qiáng)、回收率高的免疫親和柱凈化，凈化效果較佳，但BEA和ENB這2種新興毒素缺乏商品化市售免疫親和柱。文獻(xiàn)報道，采用快速Q(mào)uEChERS法凈化，BEA和ENB這2種新興真菌毒素的基質(zhì)標(biāo)曲與溶劑標(biāo)曲斜率比值分別為0.744和0.526，仍存在較強(qiáng)基質(zhì)抑制效應(yīng)，凈化效果不佳[11]。分析吸附雜質(zhì)型多功能凈化柱MycoSep 226、MycoSep 227、MycoSep 228凈化效果，結(jié)果表明，3種多功能柱均吸附BEA和ENB這2種新興真菌毒素，吸附率在90%以上，不適用于小麥粉中BEA和ENB的凈化?？疾鞂O性和非極性化合物均有保留且回收率受柱床干涸影響較小的PEP固相萃取柱凈化效果，BEA和ENB這2種新興真菌毒素的低、中、高3個濃度水平的回收率分別在76.25%～99.31%和74.60%～91.17%，滿足小麥粉中痕量BEA和ENB檢測。對比待凈化液中乙腈含量對BEA和ENB這2種新興真菌毒素回收率影響，結(jié)果表明，隨著乙腈比例增加，2種新興真菌毒素在PEP柱上保留特性顯著提高，但待凈化液中乙腈比例超過40%后，PEP固相萃取柱對BEA和ENB這2新興真菌毒素保留下降，所以采用PEP固相萃取柱凈化時，應(yīng)將樣品提取液進(jìn)行稀釋，乙腈比例控制在30%～40%，保證PEP固相萃取柱對BEA和ENB最佳保留效果。對比淋洗液中不同比例乙腈-水溶液對BEA和ENB這2種新興真菌毒素回收率影響，結(jié)果表明淋洗液中乙腈比例越高，淋洗雜質(zhì)效果越好，基質(zhì)抑制越弱，但淋洗液中乙腈比例超過40%，BEA和ENB被部分洗脫，回收率下降，淋洗液中乙腈比例50%時，ENB回收率降至80%以下，采用40%乙腈-水溶液，淋洗雜質(zhì)，減少基質(zhì)的干擾?？疾煜疵撘阂译嬗昧浚捎?.5 mL乙腈洗脫固相萃取柱中的BEA和ENB時，2種新興真菌毒素洗脫率在96%左右，目標(biāo)物洗脫不完全，所以加入1.5 mL乙腈洗脫對目標(biāo)物進(jìn)行洗脫，保證2種新興真菌毒素洗脫完全。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察

食品樣品基質(zhì)復(fù)雜，在UPLC-MS/MS分析中不可避免產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)或基質(zhì)抑制。采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線斜率和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線斜率之比（K）評價基質(zhì)效應(yīng)，K大于1時為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，K小于1時為基質(zhì)減弱效應(yīng)，K等于1時無基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果表明，BEA和ENB這2種新興真菌毒素使用PEP固相萃取柱凈化后的小麥粉空白基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比分別為0.945和0.922，即基質(zhì)抑制效應(yīng)在可接受范圍內(nèi)，為提高小麥粉中BEA和ENB定量結(jié)果準(zhǔn)確性，仍采用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量限

將BEA和ENB這2種新興真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋，用小麥粉樣品空白凈化基質(zhì)溶液配制成BEA質(zhì)量濃度為0，1.25，2.50，5.00，10.0，20.0，30.0，40.0和50.0 ng/mL以及ENB質(zhì)量濃度為0，0.625，1.25，2.50，5.00，10.0，15.0，20.0和25.0 ng/mL基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，在優(yōu)化的儀器工作條件下進(jìn)樣分析，以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、響應(yīng)值峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線，BEA和ENB基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為YBEA=2.71×105x+1.67×104（r=0.999 5）、YENB=6.17×105x+7.25×104（r=0.999 7），2種新興真菌毒素在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，以S/N=10計算方法定量限，結(jié)果分別為3和1.5 μg/kg。

2.6 方法精密度和回收率試驗(yàn)

在空白樣品中加入定量限附近、標(biāo)準(zhǔn)曲線中間點(diǎn)和高濃度點(diǎn)驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，選擇在空白小麥粉樣品中加入BEA質(zhì)量濃度為4.8，48和96 μg/kg，結(jié)果ENB質(zhì)量濃度為2.4，24和48 μg/kg低、中、高3個濃度水平的2種新興真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品，渦旋混均，放置30 min，使其樣品基質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)品充分接觸，按照1.3的樣品前處理進(jìn)行處理及測定，每個添加濃度水平測定6份平行樣，方法加標(biāo)回收率及重現(xiàn)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表2。

由表2可知，BEA和ENB測定方法平均回收率分別為76.25%～99.31%和74.60%～91.17%，小麥粉中方法的重現(xiàn)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%。與韓小敏等[15]文獻(xiàn)報道的小麥粉中BEA和ENB回收率分別為100.5%～126.0%和114.6%～123.1%相比偏低，但考察BEA和ENB加標(biāo)回收率低端濃度水平分別為50和20 μg/kg，是定量限192倍（BEA定量限0.26 μg/kg）和400倍（ENB定量限0.05 μg/kg），不能準(zhǔn)確反映出定量限附近方法的準(zhǔn)確度，所以試驗(yàn)考察定量限附近方法的加標(biāo)回收率，BEA和ENB低、中、高3個濃度水平的加標(biāo)回收率均大于70%，滿足痕量真菌毒素的分析要求。

表2 方法加標(biāo)回收率及精密度結(jié)果（n=6）

2.7 實(shí)際樣品測定

應(yīng)用試驗(yàn)方法對超市隨機(jī)購買的10批次小麥粉中BEA和ENB進(jìn)行檢測，其中2批次樣品檢出白BEA，含量分別為3.69和5.73 μg/kg；1份檢出ENB，含量為4.42 μg/kg。

3 結(jié)論

建立基于PEP固相萃取柱凈化、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測小麥粉中BEA和ENB這2種新興真菌毒素測定方法。BEA和ENB這2種新興毒素分別在0～50 ng/mL和0～25 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。在空白樣品中添加低、中、高3個濃度水平的BEA和ENB標(biāo)準(zhǔn)品，平均回收率均大于70%，方法重現(xiàn)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，采用PEP固相萃取柱凈化，有效降低小麥粉中樣品基質(zhì)的影響，適用于小麥粉中痕量BEA和ENB這2種新興真菌毒素檢測，為分析小麥粉中BEA和ENB污染水平提供參考依據(jù)。