韓忠耀，陳健，宋偉，楊政敏*，唐文雙，李仕外

1. 黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校（都勻 558000）；2. 浙江醫(yī)藥股份有限公司研究院（紹興 312500）

水冬瓜根皮來源于山茱萸科植物有齒鞘柄木Toricellia angulataOliv. var.intermedia（Harms）Hu的干燥根皮，別名大接骨丹、水五加等，被《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003版）收載[1]。在質(zhì)量控制方面，針對水冬瓜根皮藥材，可采用指紋圖譜技術(shù)及指標(biāo)性成分含量測定進(jìn)行質(zhì)量控制[2-3]。

近紅外光譜（Near infrared spectroscopy，NIR）法是收載于《中華人民共和國藥典》的藥品質(zhì)量控制新方法[4]，具有分析速度快、操作簡便、無損、綠色等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于藥品[5-6]、食品[7-8]、農(nóng)藥殘留[9]、煙草[10]等領(lǐng)域。與藥品經(jīng)典的檢測方法如高效液相色譜法、氣相色譜法、紫外-可見分光光度法、化學(xué)分析法相比，該方法既可離線快速檢測藥品中的化學(xué)成分或有效成分的含量，又可在線實時動態(tài)化開展藥品質(zhì)量監(jiān)測，且不消耗有機(jī)溶劑，是一種綠色、無污染的快速分析新技術(shù)與新方法，應(yīng)用前景廣闊。課題組前期通過AOTF-NIR技術(shù)建立了水冬瓜根皮總黃酮與浸出物的快速定量分析模型[11]，而關(guān)于采用近紅外漫反射光譜法快速測定水冬瓜根皮中紫丁香苷含量的研究尚未見報道。

試驗擬以水冬瓜根皮為研究對象，通過近紅外漫反射光譜法建立快速檢測水冬瓜根皮中紫丁香苷含量的NIR模型與快速質(zhì)量控制方法，為水冬瓜根皮快速質(zhì)量評價與檢測新方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 儀器與設(shè)備

Luminar 5030型AOTF-NIR儀（美國Brimrose公司，主要部件包括光學(xué)部分、控制部分、電源適配器。軟件包括SNAP!光譜處理軟件）；The Unscrambler化學(xué)計量學(xué)分析軟件（挪威CAMO公司）；Agilent 1260型高效液相色譜儀（DAD檢測器，美國安捷倫科技公司）；FA1004B型電子天平（萬分之一，溫州瑞昕儀器有限公司）；Sartorius BT25S電子天平（十萬分之一，德國塞多利斯公司）；烘箱（天津市泰斯特101-3AB型）；藥典篩（紹興市上虞張興紗篩廠）；WK-1000A高速粉碎機(jī)（濰坊市北方制藥設(shè)備制造有限公司）；水浴鍋。

1.1.2 試藥

紫丁香苷對照品（北京盛世康普化工技術(shù)研究院，20 mg/支，批號161214）；乙腈（康科德色譜試劑4 L，色譜純）；磷酸（AR 500 mL，萊陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠）；水為娃哈哈純凈水（浙江娃哈哈集團(tuán)有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.1.3 樣本采集

水冬瓜根皮藥材為自采，采集地點(diǎn)為貴州省都勻杉木湖溝渠（經(jīng)度107°30′52.33″E，緯度26°15′46.16″N，海拔807 m），自采樣本均經(jīng)韓忠耀副教授鑒定為山茱萸科植物有齒鞘柄木Toricellia angulataOliv. var. intermedia（Harms）Hu的根皮。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

取G1～G48批次水冬瓜根皮鮮藥材，經(jīng)烘箱55 ℃烘干，粉碎，過220 μm篩，混勻，即得。

1.2.2 光譜采集方法

應(yīng)用AOTF-NIR儀SNAP!光譜處理軟件建立光譜采集方法。波長掃描范圍，1 100～2 300 nm；波長增量，2 nm；測量方式，漫反射；增益調(diào)節(jié)，×1；樣品類型，int. Ref.；數(shù)據(jù)格式，透過率；掃描方式，比率模式；掃描累計次數(shù)，230次。

1.2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性條件

Agela Promosil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），檢測波長220 nm，進(jìn)樣量5 μL，柱溫35 ℃，流速1.0 mL·min-1，流動相為0.5%-磷酸溶液（A）-乙腈（B），流動相洗脫條件見表1，流動相洗脫時間30 min。

表1 高效液相色譜流動相洗脫條件

1.2.4 對照品溶液的制備

取適量紫丁香苷對照品，精密稱定，加入于25 mL量瓶中，取適量分析純甲醇，超聲溶解，再加入甲醇稀釋到刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為1.622 9 mg·mL-1的紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液[3]。

1.2.5 供試品溶液的制備

取1.2.1小節(jié)各批次樣品粉末，每份約0.5 g，精密稱定，用甲醇回流提取1 h，過濾，濾液分別用0.45μm微孔濾膜過濾，續(xù)濾液分別置于液相小瓶中，即得各供試品溶液。

1.2.6 方法學(xué)考察

1) 線性關(guān)系考察：參照文獻(xiàn)[3]方法，分別精密吸取0，0.5，1，2，3，4和5 mL 1.2.4小節(jié)的對照品儲備液于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋到刻度，按1.2.3小節(jié)色譜條件進(jìn)行分析。

2) 精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性試驗：參照文獻(xiàn)[3]。

3) 加樣回收率試驗：取6份已知含量的G1批次藥材提取液，精密加入適量紫丁香苷對照品溶液進(jìn)行試驗。

1.3 NIR光譜預(yù)處理與數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件對紫丁香苷含量檢測理化值進(jìn)行處理。利用美國Brimrose公司SNAP!光譜處理軟件，對NIR光譜進(jìn)行預(yù)處理。利用挪威CAMO公司The Unscrambler化學(xué)計量學(xué)分析軟件關(guān)聯(lián)NIR光譜與紫丁香苷理化數(shù)據(jù)，構(gòu)建NIR定量PLS分析模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系考察結(jié)果

以紫丁香苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，以紫丁香苷HPLC峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為Y=6 814.4X-11.501，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 6，結(jié)果表明線性考察結(jié)果良好。

2.1.2 其他方法學(xué)考察結(jié)果

由表2可知，儀器的精密度與方法的重復(fù)性良好，同時供試品在36 h內(nèi)，穩(wěn)定性δRSD小于3%，表明供試品36 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

表2 方法學(xué)考察試驗結(jié)果

2.1.3 加樣回收率試驗

結(jié)果表明，紫丁香苷的平均加樣回收率為103.18%，且δRSD為2.72%，表明所建立的方法回收率良好。

2.2 NIR掃描結(jié)果

48批次水冬瓜根皮藥材近紅外漫反射光譜圖見圖1。

圖1 48批次水冬瓜根皮藥材NIR光譜圖

2.3 近紅外定量校正模型的建立與驗證

2.3.1 校正集與驗證集的確定

將42批次水冬瓜根皮藥材作為校正集（G1～G42），6批次作為驗證集（G43～G48）。

2.3.2 近紅外光譜預(yù)處理方法的選擇

為更好地建立水冬瓜根皮紫丁香苷近紅外快速質(zhì)量評價定量分析模型，通過相關(guān)系數(shù)（R）、校正均方根誤差（RMSEC）、預(yù)測均方根誤差（RMSEP）、預(yù)測相對偏差（RSEP）來考察模型性能。R越接近1表示模型的預(yù)測值與標(biāo)準(zhǔn)對照方法分析值之間的相關(guān)性越好；RMSEC和RMSEP的大小與樣品化學(xué)值相關(guān)，這兩個參數(shù)越小越接近，則表明模型性能越佳，預(yù)測精度越高；同時，RSEP越小越佳。不同光譜預(yù)處理方法見表3。

表3 不同光譜預(yù)處理方法對定量校正模型性能的影響

2.3.3 近紅外建模波段的選擇

根據(jù)表3，“Add constant+Smooth”為光譜的相對較佳預(yù)處理方式，為更好地降低冗余信息及降低噪聲干擾，采用Add constant+Smooth優(yōu)化水冬瓜根皮藥材中紫丁香苷含量測定最佳波段，波長優(yōu)化條件見表4。

從表4可以看出，在1 100～2 200 nm波段，紫丁香苷近紅外校正模型的RMSEC與RMSEP相對較小且比較接近，相關(guān)系數(shù)R無顯著性差異，RSEP值最小，因此，結(jié)合表3和表4，最終確定NIR光譜預(yù)處理方式：1 100～2 200 nm波段下，采用Add constant+Smooth預(yù)處理NIR光譜，構(gòu)建水冬瓜根皮藥材紫丁香苷含量NIR快速定量分析模型。

表4 近紅外光譜波段優(yōu)化

2.3.4 紫丁香苷NIR定量校正模型的建立

按照2.3.2與2.3.3小節(jié)的建模優(yōu)化條件，將42批次水冬瓜根皮樣本作為校正集（G1～G42），6批次作為驗證集（G43～G48），選擇1 100～2 200 nm波段，采用Add constant+Smooth方式對NIR原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，導(dǎo)入The Unscrambler化學(xué)計量學(xué)分析軟件，將G1～G42的光譜信息與樣品紫丁香苷含量理化參考值進(jìn)行數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，建立水冬瓜根皮樣本的紫丁香苷的偏最小二乘法（PLS）NIR校正集定量分析模型。結(jié)果顯示：RMSEC=0.935 9，RMSEP=1.191 0，RSEP=0.142 7，R=0.983 6。紫丁香苷的實測值與預(yù)測值的Matrix Plot圖見圖2，紫丁香苷預(yù)測值與真實值相關(guān)圖見圖3。

2.3.5 模型驗證

將水冬瓜根皮驗證集樣本G43～G48的NIR原始光譜經(jīng)2.3.2與2.3.3小節(jié)的建模優(yōu)化條件預(yù)處理后的uns格式光譜數(shù)據(jù)，導(dǎo)入The Unscrambler化學(xué)計量學(xué)分析軟件，對6批次樣品進(jìn)行模型預(yù)測，紫丁香苷定量模型的絕對誤差見表5，表明所建模型驗證效果較好。

圖2 水冬瓜根皮的紫丁香苷預(yù)測值與真實值Matrix Plot圖

圖3 水冬瓜根皮的紫丁香苷預(yù)測值與真實值相關(guān)圖

表5 紫丁香苷模型預(yù)測結(jié)果

3 討論

紫丁香苷為水冬瓜根皮中的有效成分[12]，試驗通過近紅外光譜法建立了其快速、無損、綠色的NIR定量分析模型，模型經(jīng)驗證預(yù)測結(jié)果理想。近紅外光譜法不僅可以用于水冬瓜根皮中紫丁香苷的含量測定，也可用于其真?zhèn)舞b別[13-15]。通過主成分分析（PCA）法建立正品水冬瓜根皮樣本的NIR模型，可以快速對偽品及摻雜品進(jìn)行快速定性判別分析，同時可采用正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）等化學(xué)計量學(xué)方法對其進(jìn)行綜合質(zhì)量評價，相關(guān)問題有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

試驗以黔產(chǎn)水冬瓜根皮藥材（Toricellia angulataOliv. var. intermedia（Harms）Hu）為研究對象，通過近紅外漫反射光譜法與理化參考值數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，應(yīng)用挪威CAMO公司The Unscrambler化學(xué)計量學(xué)分析軟件，構(gòu)建了水冬瓜根皮藥材中紫丁香苷含量快速定量分析最小二乘（PLS）法近紅外光譜模型。該模型驗證回收率高，相對誤差反映模型預(yù)測值與理化參考值的可信程度較高，實現(xiàn)了對水冬瓜根皮藥材無損、綠色、快速質(zhì)量評價，為黔產(chǎn)水冬瓜根皮中紫丁香苷快速分析提供了一種新方法，同時為食品、煙草、糧食、藥品等快速、綠色、無損檢測與分析提供借鑒與參考。

綜上所述，試驗所建立的NIR快速檢測方法穩(wěn)定、可靠、簡便，可用于水冬瓜根皮中紫丁香苷含量的快速檢測，生產(chǎn)實際應(yīng)用前景廣闊，為其快速質(zhì)量控制與評價提供參考與思路。