張?chǎng)?，湯學(xué)英，崔亞楠，李明陽，雷舒涵，周鑫*

1. 唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心（唐山 063000）；2. 河北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)創(chuàng)新中心（唐山 063000）

喹諾酮類藥物（Quinolones）是一類重要的人工合成廣譜抗菌藥[1-2]，這類藥物的作用機(jī)制是通過抑制細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶的活性，影響細(xì)菌的正常代謝和繁衍，因其良好藥效，被廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖等產(chǎn)業(yè)中[3]。但這類藥物及其代謝產(chǎn)物可以蓄積在動(dòng)物體內(nèi)，形成不同程度的藥物殘留。如果長(zhǎng)期食用喹諾酮類藥物殘留超標(biāo)的牛奶，可能會(huì)引起皮疹、過敏等應(yīng)激反應(yīng)，影響人體腸道中正常菌群生長(zhǎng)；低濃度的殘留藥物也可能誘導(dǎo)致病菌產(chǎn)生耐藥性，潛在危害人體健康[4]。中國(guó)從食品安全角度考慮，相繼出臺(tái)和頒布相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和公告，對(duì)禁用的喹諾酮類藥物和食品中的獸藥最大殘留限量提出相關(guān)要求[5-6]。

測(cè)定牛奶中喹諾酮類藥物殘留的主要方法有酶聯(lián)免疫法[7]、蛋白芯片法[8]、液相色譜法[9-10]、液質(zhì)聯(lián)用法[11-12]、化學(xué)發(fā)光法[1]、免疫層析法[13]等。已報(bào)道的方法雖然可對(duì)喹諾酮類藥物進(jìn)行檢測(cè)分析，但在方法選擇性和定性能力方面仍存在不足[14]。線性離子阱質(zhì)譜（Q Trap）與三重四極桿質(zhì)譜的區(qū)別在于其具有多反應(yīng)監(jiān)測(cè)-信息關(guān)聯(lián)采集-增強(qiáng)子離子掃描（MRMIDA-EPI）的信息采集模式，MRM掃描的信號(hào)強(qiáng)度超過設(shè)定閾值時(shí)，采集模式將在短時(shí)間內(nèi)自動(dòng)切換為線性離子阱模式進(jìn)行增強(qiáng)子離子掃描（EPI），獲得對(duì)應(yīng)MRM通道中超過閾值的目標(biāo)化合物的高質(zhì)量二級(jí)質(zhì)譜圖，該掃描模式響應(yīng)強(qiáng)度高，離子信息豐富，通過與譜庫檢索對(duì)比，實(shí)現(xiàn)一次進(jìn)樣完成定性和定量分析[15-19]。

采用QuEChERS方法對(duì)牛奶樣品進(jìn)行前處理，采用超高效液相色譜線性離子阱質(zhì)譜對(duì)喹諾酮類藥物進(jìn)行分析，建立同時(shí)檢測(cè)牛奶中16種喹諾酮類藥物殘留的分析方法，為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

16種喹諾酮類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)品（諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依諾沙星、洛美沙星、沙拉沙星、萘啶酸、惡喹酸、氟甲喹、達(dá)氟沙星、雙氟沙星、司帕沙星、奧比沙星、氟羅沙星混合液標(biāo)，天津阿爾塔公司）；乙腈、甲酸（色譜純，德國(guó)默克公司）；純凈水（杭州娃哈哈公司）。

QuEChERS凈化管（150 mg PLS-A，50 mg PSA，Dikma公司，15 mL ProElut QuEChERS）。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜儀（Shimadzu SIL-30A，日本島津公司）；三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀（4000 Q TRAP，美國(guó)AB SCIEX公司）；高速離心機(jī)（SORVALL LYNX 4000，美國(guó)賽默飛公司）。

1.3 前處理方法

取2.0 mL牛奶樣品，加入8.0 mL 0.2%甲酸乙腈，渦旋混合1 min，振蕩提取5 min，超聲提取5 min，以8 000 r/min離心5 min，取上清液待凈化轉(zhuǎn)移到15 mL QuEChERS凈化管，渦旋混合1 min，8 000 r/min離心5 min，取5.0 mL上清液于40 ℃氮吹至近干，用10%乙腈水溶液定容至1.00 mL，渦旋混勻，過0.22 μm微孔濾膜，上機(jī)待分析。

1.4 液相色譜條件

色譜柱采用ACQUITY UPLC BEH C18液相色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters公司）；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；柱溫35 ℃；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈。梯度洗脫條件：0～2.0min，A保持在90%；2.0～6.0 min，A由90%下降到5%；6.0～9.0 min，A保持在5%；9.0～9.1 min，A由5%上升到90%；9.1～13.0 min，A保持在90%。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源采用電噴霧（ESI）；檢測(cè)方式采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)-信息關(guān)聯(lián)掃描-增強(qiáng)子離子掃描（MRM-IDAEPI）；掃描方式采用正離子掃描；離子源溫500 ℃；霧化氣50 psi；輔助氣50 psi；碰撞氣，高；噴霧電壓5 000 V；入口電壓10 V。

增強(qiáng)子離子掃描范圍50～400m/z，掃描速度4 000 Da/s；離子阱碰撞能量35±15 V；喹諾酮類藥物檢測(cè)離子對(duì)信息、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）見表1。

表1 喹諾酮類藥物的選擇離子及碰撞能量

2 結(jié)果與討論

2.1 液相及質(zhì)譜方法優(yōu)化

選擇乙腈和甲醇作為有機(jī)相對(duì)喹諾酮藥物進(jìn)行洗脫，比較發(fā)現(xiàn)甲醇可提升喹諾酮類藥物分離度；乙腈可使喹諾酮藥物的峰形更好，儀器響應(yīng)值高，提升檢測(cè)靈敏度。由于應(yīng)用MRM掃描，各目標(biāo)化合物有各自的離子對(duì)信息，故條件優(yōu)化著重于響應(yīng)強(qiáng)度因素，使用乙腈作為流動(dòng)相。選擇喹諾酮類藥物在質(zhì)譜掃描方式上均為正掃描，母離子為[M+H]+形式，故而在水相流動(dòng)相選擇上用0.1%甲酸水溶液，以對(duì)流動(dòng)相體系提供游離H+，提高目標(biāo)化合物容易離子化效率，與此同時(shí)優(yōu)化質(zhì)譜的電壓、電位、氣流等參數(shù)。16種喹諾酮類藥物的色譜圖見圖1。

圖1 16種喹諾酮類藥物多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖

2.2 線性離子阱定性分析

線性離子阱質(zhì)譜為離子阱質(zhì)譜的一種，其三重四極桿結(jié)構(gòu)的Q3有對(duì)感興趣的離子捕獲、阱集等功能。增強(qiáng)子離子掃描（EPI）與多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）的掃描模式通過信息關(guān)聯(lián)采集（IDA）連接，在MRM掃描的同時(shí)獲得目標(biāo)化合物的特征性二級(jí)質(zhì)譜信息，增強(qiáng)了定性能力。將標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，采集到的EPI譜圖（圖2為達(dá)氟沙星標(biāo)液EPI掃描譜圖），編輯入標(biāo)準(zhǔn)譜庫；對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行測(cè)定，觸發(fā)EPI掃描時(shí)，用采集到EPI譜圖進(jìn)行譜庫檢索。結(jié)合保留時(shí)間和離子豐度比，疑似陽性樣品二級(jí)質(zhì)譜圖與譜庫中標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行相似度比對(duì)，擬定purity數(shù)值大于70%時(shí)，疑似陽性樣品為目標(biāo)化合物的檢出[20]。

圖2 達(dá)氟沙星的增強(qiáng)子離子掃描質(zhì)譜圖

2.3 方法線性范圍及定量限

采用外標(biāo)法對(duì)牛奶中的喹諾酮類藥物進(jìn)行定量分析。用空白牛奶基質(zhì)溶液配制不同梯度濃度的標(biāo)液，上機(jī)進(jìn)行測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在2～100 ng/mL線性范圍內(nèi)，各喹諾酮類藥物線性方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，呈現(xiàn)出良好線性關(guān)系。方法設(shè)定S/N＞10為定量限，確定方法定量限為0.5～2 μg/L，結(jié)果見表2。

表2 喹諾酮類藥物線性方程相關(guān)系數(shù)、定量限以及方法回收率、精密度

2.4 回收率和精密度

取空白牛奶樣品，分別選擇2，10和50 μg/L這3種質(zhì)量濃度對(duì)其進(jìn)行16種喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)品添加，進(jìn)行定量分析，計(jì)算添加回收率和精密度（n=6），結(jié)果見表2。

3 結(jié)論

應(yīng)用QuECHERS-UHPLC-MRM-IDA-EPI方法對(duì)牛奶中16種喹諾酮類藥物殘留進(jìn)行測(cè)定分析。方法操作安全、簡(jiǎn)便、高效，且準(zhǔn)確性、重復(fù)性好，在MRM掃描模式保證定量準(zhǔn)確的同時(shí)，利用線性離子阱的阱集功能，高響應(yīng)強(qiáng)度的EPI二級(jí)質(zhì)譜圖和標(biāo)準(zhǔn)譜庫的對(duì)比加強(qiáng)對(duì)喹諾酮類藥物的定性功能，降低喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)假陽性的概率。