彭修春，糟龍，曹甜甜，張春蘭, *

1. 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（阿拉爾 843300）；2. 南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（阿拉爾 843300）

大豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源，由于具有良好的營養(yǎng)價(jià)值、功能特性，已被廣泛應(yīng)用于食品配料和功能性添加劑等食品工業(yè)中[1]。大豆蛋白除具有優(yōu)異的熱誘導(dǎo)凝膠性質(zhì)外，還表現(xiàn)出良好的乳化特性[2]。大豆蛋白的乳化性質(zhì)主要是作為加工助劑，如在粉碎性肉類加工領(lǐng)域作為肉類乳化劑等，而大豆蛋白作為乳化劑在液態(tài)食品中的應(yīng)用有限[3]。造成這種情況的主要原因是，大豆分離蛋白（SPI）作為一種具有復(fù)雜低聚物結(jié)構(gòu)的多組分混合物，其功能特性不僅高度依賴于類型、成分和性質(zhì)，如熱變性和聚合程度等，也易受到各種處理過程和環(huán)境條件的影響，如pH、溫度、鹽和其他組分的存在[4]。因此，應(yīng)改進(jìn)大豆蛋白的功能特性使其更好地得到應(yīng)用。

蛋白能通過靜電斥力和空間位阻來防止乳滴的絮凝，但對pH和離子強(qiáng)度非常敏感[5-6]。非離子表面活性劑主要通過空間位阻來穩(wěn)定乳液，對pH和離子強(qiáng)度不敏感[7]。界面上存在的乳化劑類型會影響乳液的穩(wěn)定性。小分子表面活性劑，如吐溫、司盤等以其極易在油水界面展開，降低表面張力能力強(qiáng)且可形成小的粒徑的特性而廣泛應(yīng)用于食品、藥品領(lǐng)域。乳液的物理化學(xué)性質(zhì)依賴于存在的成分及成分之間的相互反應(yīng)，因此通常利用各種穩(wěn)定劑和乳化劑提高乳液的穩(wěn)定性[8]。非離子表面活性劑會通過競爭吸附影響蛋白乳滴的界面性質(zhì)，從而表現(xiàn)出不同特性。因此，試驗(yàn)采用常用的非離子表面活性劑吐溫80與大豆分離蛋白混合作為乳化劑，探究不同吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對其乳液粒徑、電位、pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性等物理特性的影響，以期大豆分離蛋白乳液在食品加工中得到更廣泛的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

聚氧乙烯失水山梨醇單油酸酯（Tween 80，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；大豆分離蛋白（SPI，上海源葉生物科技有限公司）；中鏈甘油三酸酯（武漢博星化學(xué)試劑公司）；氫氧化鈉，鹽酸，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉等（均為國產(chǎn)分析純）。

LE203E電子天平（梅特勒托利多儀器有限公司）；UM-4T UM系列磁力攪拌器（北京優(yōu)晟聯(lián)合有限公司）；pHS-2C型酸度計(jì)（上海儀電科學(xué)股份有限公司）；ZEN3700馬爾文粒度儀、激光粒度儀Malven 2000（英國Malvern儀器有限公司）；J6紫外可見分光光度計(jì)（上海箐華科技儀器有限公司）；JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TGL-16C型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 乳液制備

用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH 7）將SPI粉配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的溶液，置于磁力攪拌器上攪拌2 h，置4 ℃冰箱過夜，使蛋白充分水合。第2天將溶液于4 000 r/min離心10 min后取清液作為乳化劑，同時(shí)加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的吐溫80（0，0.1%，0.2%，0.3%和0.4%），加入5%的MCT，將其在冰浴里冷卻20 min后，置于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)內(nèi)，用超聲波探頭深入溶液表面1～2 cm處理，在冰浴條件下以超聲頻率20kHz、輸出功率800 W進(jìn)行溶液超聲。每超聲5 s，停止超聲5 s，作用時(shí)間共10 min。超聲結(jié)束后，將乳液放入4 ℃冰箱過夜，用于分析測定。

1.3 乳液穩(wěn)定性

1.3.1 pH對乳液穩(wěn)定性的影響

制備好含油量5%乳液后置于4 ℃冰箱過夜，用NaOH或HCl溶液將其分別調(diào)至pH 3～7。取出10 mL樣品于玻璃小瓶中，室溫避光貯存24 h后，測定其粒徑和電位。

1.3.2 溫度對乳液穩(wěn)定性的影響

在pH 7條件下制備的含油量5%乳液，置于50～90℃水浴鍋中水浴30 min，水浴完畢后流水冷卻，測定粒徑。

1.3.3 離子強(qiáng)度對乳液穩(wěn)定性的影響

在pH 7條件下制備的含油量5%乳液，分別加入相同pH的等體積的NaCl溶液，混合并且攪拌10 min，形成一系列不同NaCl濃度（0～0.5 mol/L）的樣品，置于玻璃小瓶中，暗處室溫貯存24 h后，測定其粒徑和電位。

1.4 界面蛋白質(zhì)吸附量的測定

乳液界面吸附的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（ωAP）可使用修改后的方法測定[10]。取1 mL樣品乳液在室溫下于10 000 r/min離心30 min。離心完畢后，對兩相進(jìn)行觀察。奶油狀油滴在頂部，而乳液的水相在底部。小心除去上層膏狀，取下層水相用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。初始蛋白質(zhì)溶液也在相同條件下測定。吸附的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)用式（1）計(jì)算。

式中：C0為初始蛋白質(zhì)濃度；C為下層水相中蛋白質(zhì)濃度。

1.5 乳液的粒徑和表面電荷測定

利用激光粒度儀Malven 2000，ZEN3700粒度儀測定乳液的粒徑和電位。乳液用相應(yīng)pH的緩沖液稀釋100倍后，測定乳液粒徑及乳液表面電荷。

2 結(jié)果與分析

2.1 吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳液形成的影響

探究吐溫80對蛋白穩(wěn)定的乳液形成的影響，使體系中MCT含量保持在5%，而吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～0.4%呈梯度變化，并通過超聲法制備乳液。由圖1可以看出，吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳液粒徑影響較大。SPI作為唯一乳化劑時(shí)，會生成相對較大的乳滴（d32=（488.2±19.16）nm）。SPI與吐溫80混合作為乳化劑時(shí)，則能生成更小的液滴。隨著吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0增加到0.4%，乳液粒徑顯著降低。

乳化劑對乳滴粒徑的影響高度依賴于乳化劑的性質(zhì)和濃度。由于蛋白吸附存在擴(kuò)散、吸附和構(gòu)象重排3個(gè)步驟，低的吸附速率導(dǎo)致在使用超聲波乳化時(shí)無法瞬間飽和吸附和穩(wěn)定納米級液滴[11]，因此單獨(dú)以SPI為乳化劑時(shí)粒徑比較大。而吐溫80極易在油水界面展開，能快速降低表面張力，故可形成小的粒徑。

表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時(shí)，大量的表面活性劑在油-水界面吸附，其吸附速率隨濃度增加，并會使界面張力顯著降低[12]，從而更有利于小乳滴形成，其他學(xué)者也認(rèn)為表面活性劑濃度較高時(shí)，形成的乳液粒徑更小[13]。同時(shí)，界面張力減小對后續(xù)均質(zhì)過程十分重要，因?yàn)橛兄谶M(jìn)一步破壞乳液液滴，減少超聲所需能量[14]。

圖1 吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳滴平均粒徑的影響

2.2 乳液穩(wěn)定性分析

2.2.1 pH對乳液穩(wěn)定性的影響

為探究在使用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)吐溫80時(shí)，pH對乳液穩(wěn)定性的影響，測定在不同pH條件下乳滴的電位和平均粒徑。不使用吐溫80時(shí)，隨著體系的從pH 7降至pH 3（圖2），乳滴的帶電量從較高的負(fù)電荷（（-30.5±2.2）mV）上升到較高的正電荷（（23.9±3.81）mV）。這種現(xiàn)象可歸因于有一層SPI吸附在油滴表面，而且這個(gè)蛋白的等電點(diǎn)（pI）在pH 4.8左右[15]。因此，pH在等電點(diǎn)以下時(shí)，由于—NH3+和—COOH基團(tuán)占優(yōu)勢，乳滴將帶正電；pH高于等電點(diǎn)時(shí)，由于COO—和—NH2占優(yōu)勢，乳滴將帶負(fù)電。在混合吐溫80后制備的乳液，乳滴在pH 3～7體系中，吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，電位變化越穩(wěn)定。

圖2 不同pH條件下吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳滴電位的影響

隨著吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，電荷變化顯著減小。吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%和0.2%時(shí)，乳滴仍帶明顯電荷，但吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%和0.4%時(shí)，pH 3時(shí)乳滴所帶電荷接近于0（（0.858±0.595）mV）。這可能是因?yàn)橥聹?0競爭油滴表面，吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低（≤0.2%）時(shí)，乳滴界面上的蛋白質(zhì)被部分競爭，仍有一些SPI留下并促成乳滴的電特性；吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高（≥0.3%）時(shí)，油滴界面完全被吐溫80取代，由于吐溫80為電中性，從而使得乳滴的帶電量接近于0。在表面活性劑濃度相對較低條件下，會與蛋白質(zhì)共同吸附在油滴表面，而在表面活性劑濃度足夠高時(shí)，蛋白質(zhì)可能將被完全取代[16]。

大豆分離蛋白穩(wěn)定的乳液對pH較為敏感，在中性條件下，乳液較穩(wěn)定，而pH 3～5時(shí)乳液呈高度不穩(wěn)定狀態(tài)，出現(xiàn)乳滴絮凝/聚集現(xiàn)象（圖3）。這主要是因?yàn)閜H 3～5時(shí)，乳滴的表面電荷少，乳滴之間的靜電排斥力小于范德華力和空間位阻，從而造成乳滴的聚集，液滴粒徑變大（d32=（7 177±181.2）nm）。隨著吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，乳滴粒徑相對pH逐漸變得不敏感。吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.3%時(shí)，pH對乳液的粒徑并沒有產(chǎn)生影響。這可能是因?yàn)殡S著吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，乳滴界面上吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)也逐漸增加。這類非離子型表面活性劑呈電中性，不易受pH影響而發(fā)生變化，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時(shí)能夠使乳液體系保持較好的物理穩(wěn)定性。

圖3 不同pH條件下吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳滴平均粒徑的影響

2.2.2 溫度對乳液穩(wěn)定性的影響

由于SPI變性溫度范圍為70～80 ℃，溫度高于變性范圍時(shí)，蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性基團(tuán)在此過程中發(fā)生部分外露，蛋白質(zhì)亞基組分解離，解離的大豆蛋白重新折疊形成更穩(wěn)定熱聚體，從而使得平均粒徑均略有增加（圖4）。添加吐溫80后，液滴大小相對溫度變化不明顯。

圖4 不同溫度下吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳滴平均粒徑的影響

2.2.3 離子強(qiáng)度對乳液穩(wěn)定性的影響

乳液中未添加吐溫80時(shí)，隨著離子強(qiáng)度增加，液滴大小顯著變大。由初始的較小液滴（d32=（488±1.98）nm）增加到較大的粒徑d32=（7 309±114.8）nm（CNaCl=0.5 mol/L）。這是因?yàn)辂}離子屏蔽了乳滴之間的靜電斥力，含鹽量較低時(shí)，靜電斥力仍然足以克服范德華力和疏水引力，但是含鹽量高于某一臨界值后，靜電斥力就不夠強(qiáng)大，因此分子間吸引力占據(jù)優(yōu)勢地位，從而導(dǎo)致液滴聚集[19]。相關(guān)的研究報(bào)道，NaCl的添加會降低能量勢壘，從而使得乳液不穩(wěn)定，并因此增加乳滴聚集趨勢[20]。

添加吐溫80后，液滴大小隨離子強(qiáng)度變化而變化的趨勢不明顯。吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%時(shí)，液滴由初始狀態(tài)（d32=（413.3±25.53）nm）隨離子強(qiáng)度增加而增加，NaCl濃度500 mmol/L時(shí)可達(dá)到最大（d32=（1 144±81.01）nm）。但吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高（＞0.2%）時(shí)，液滴隨離子強(qiáng)度增加變化不大（圖5），即此時(shí)乳液對離子強(qiáng)度變化不敏感，NaCl的存在并不影響液滴大小，乳液仍能保持原有穩(wěn)定。

圖5 不同離子強(qiáng)度下吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳滴平均粒徑的影響

由圖6可以看出，隨著NaCl濃度增加，各乳液表面電荷逐漸減小，這主要是由于鹽離子的靜電屏蔽作用。在乳液的初始狀態(tài)，未加入NaCl時(shí)，此時(shí)pH 7高于等電點(diǎn)（pH 4.8），由于COO—和—NH2占優(yōu)勢，乳滴帶有大量負(fù)電荷，但隨著吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，乳液液滴的帶電量顯著減?。▓D6）。這可能是因?yàn)橥聹?0取代界面上的蛋白質(zhì)，改變它們的結(jié)構(gòu)和特性。吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高時(shí)，蛋白質(zhì)被取代的數(shù)量逐漸增加，甚至被完全取代[21]。由于吐溫80呈電中性，因此界面上吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，使得液滴帶電量逐漸降低。隨著吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，含鹽量對液滴帶電量和液滴大小的影響顯著減小。

圖6 不同離子強(qiáng)度下吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳滴Zeta電位的影響

2.3 界面蛋白質(zhì)吸附量的測定

吐溫80是良好的表面活性劑，能夠快速吸附到油—水界面上，降低油—水界面的界面張力，起到乳化和穩(wěn)定乳狀液的作用[22]。圖7表明，隨著吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，乳滴界面上吸附的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)從100%逐漸降低至0。吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)增至0.2%時(shí)，乳滴界面上吸附的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯降低（15.3%）。研究結(jié)果進(jìn)一步解釋吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對大豆分離蛋白乳液的影響，由于吐溫80的競爭性取代，致使乳滴界面上吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)增多而蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。

圖7 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)吐溫80對乳液的蛋白質(zhì)吸附量的影響

3 結(jié)論

通過混合吐溫80超聲制備SPI乳液，對乳液液滴粒徑有較大影響。隨著吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0～0.4%）逐漸升高，液滴的平均直徑逐漸從（488.2±19.16）nm減小到（225.7±15.98）nm；吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%～0.4%時(shí)，乳液對鹽離子的耐受性增強(qiáng)；吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%～0.4%時(shí)，乳液在不同pH環(huán)境下均能保持相對穩(wěn)定；加熱處理時(shí)，吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳液穩(wěn)定性無明顯影響；界面蛋白吸附量結(jié)果表明，隨著吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，界面蛋白吸附量降低。試驗(yàn)結(jié)果為吐溫80混合SPI乳液在食品加工中的應(yīng)用提供參考。