周泊寧，孫晶*

錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（錦州 121001）

生姜，屬姜科植物。在我國，除東北外大部分地區(qū)均有栽培。作蔬菜和調(diào)味品供食?！侗静菥V目》記載：“姜，辛而不葷，去邪辟惡，生啖熟食，醋、醬、糟、鹽、蜜煎調(diào)和，無不宜之，可蔬可茹，可果可藥，其利博矣。”為溫肺暖脾養(yǎng)生食品[1]?，F(xiàn)代研究表明生姜還具有良好的抗氧化活性以及藥用價(jià)值，受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[2]。生姜中的化學(xué)成分極其復(fù)雜，主要分為兩個(gè)部分，一部分是具有辛辣風(fēng)味的非揮發(fā)性物質(zhì)，另一部分是具有濃厚香氣的揮發(fā)性物質(zhì)[3]。普遍認(rèn)為非揮發(fā)性提取物為生姜中的主要活性部分，姜酚是生姜中的辣味物質(zhì)，也是生姜中的有效部分之一?，F(xiàn)有研究證實(shí)姜酚具有抗?jié)儭⒖寡趸?、可以刺激血液循環(huán)以及防衰老抑制腫瘤等多種功效[4]。姜酚的種類有很多，其中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚含量較多[5]。因?yàn)榻宇惢衔锘瘜W(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，極易受到酸、堿等因素影響，所以姜酚的提取分離及含量的測(cè)定都具有較大難度，對(duì)于生姜中姜酚提取工藝的研究具有現(xiàn)實(shí)意義[6]。常見的生姜提取物輔助提取技術(shù)包括微波法、超聲輔助提取法及生物輔助提取法等[7]。在超聲波輔助法中可運(yùn)用超聲波作用產(chǎn)生空化效應(yīng)和強(qiáng)烈的振動(dòng)加快目標(biāo)提取物的溶出。纖維素酶作為健康安全的復(fù)合酶，在食品加工過程中被廣泛使用[8]。纖維素酶依據(jù)植物細(xì)胞壁的組成成分，利用酶的高度專一性等特點(diǎn)，在普通溶劑提取的基礎(chǔ)上，加入相應(yīng)的酶對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，將生姜細(xì)胞壁的組成成分降解或者水解，把細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)破壞，增加其通透性，使目標(biāo)物質(zhì)暴露出來。膠溶或溶解于溶劑中，達(dá)到增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)溶物質(zhì)溶出的目的，是提取胞內(nèi)有效成分的一種新型提取方法[9]。對(duì)于纖維素酶法協(xié)同超聲波提取生姜中活性物質(zhì)研究較少，試驗(yàn)通過響應(yīng)面法對(duì)纖維素酶協(xié)同超聲波法提取姜酚的工藝進(jìn)行優(yōu)化，探討對(duì)姜酚提取率的影響，以期獲得高效的姜酚提取方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

萊蕪大姜（錦州市大潤發(fā)超市）。

纖維素酶（30 U/mg）、香草醛標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）（上?；菔郎噭┯邢薰荆?；濃硫酸、無水乙醇、苯酚、碳酸鈉、葡萄糖、福林酚試劑（均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UV-2550紫外分光光度儀（日本Shimadzu公司）；HH-S2型電熱恒溫水浴鍋（金壇市良友儀器有限公司）；電子分析天平（北京奧多利斯天平有限公司）；GL20M高速冷凍離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義予華儀器有限公司）；真空冷凍干燥機(jī)（美國Labconco公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生姜提取液的制備

精密稱取0.2 g低溫烘干，過孔徑0.150 mm篩的生姜粉末，加入適量纖維素酶溶液溶解于蒸餾水中。酶解后的液體在50 ℃下用無水乙醇進(jìn)行萃取，將雜質(zhì)沉淀后對(duì)樣品用超聲法處理30 min得到生姜提取液，將提取液以5 000 r/min離心10 min，抽濾，取上清液待用[10]。

1.3.2 香草醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

因?yàn)橄悴萑?biāo)準(zhǔn)品與姜酚結(jié)構(gòu)相似，所以選用香草醛作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]。配制20 μg/mL香草醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，用無水乙醇稀釋定容，得到質(zhì)量濃度分別為2，4，6，8，10和12 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用無水乙醇作為空白對(duì)照。用比色皿在波長280 nm處測(cè)定的吸光度，求得回歸方程為y=0.067 3x-0.004 7，R2=0.999 3。

圖1 香草醛標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.3 姜酚的測(cè)定

用無水乙醇稀釋上清液于10 mL容量瓶中定容，利用紫外分光光度法測(cè)定姜酚得率。在波長280 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出姜酚質(zhì)量濃度，按式（1）計(jì)算出姜酚得率[12]。

姜酚得率=2.001V0V1C/（V2W×106）×100% （1）式中：2.001為香草醛換算成姜酚的系數(shù)；V0為樣品提取液總體積，mL；V1為測(cè)定樣液總體積，mL；C為溶液質(zhì)量濃度，μg/mL；V2為測(cè)定時(shí)吸取的樣品供試液體積，mL；W為稱取的樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4.1 纖維素酶添加量對(duì)姜酚得率的影響

準(zhǔn)確稱取5份粉碎干燥的生姜粉末，料液比1︰70（g/mL），酶解溫度45 ℃時(shí)，分別在纖維素酶添加量為0.40%，0.85%，1.30%，1.75%和2.20%條件下提取60 min，用功率為135 W、溫度60 ℃的超聲波清洗機(jī)中提取30 min，考察纖維素酶添加量對(duì)姜酚得率的影響。

1.3.4.2 酶解溫度對(duì)姜酚得率的影響

準(zhǔn)確稱取5份粉碎干燥的生姜粉末，料液比1︰70（g/mL），纖維素酶添加量1.30%時(shí)，溫度分別為35，40，45，50和55 ℃酶解60 min，采用功率135 W、溫度60 ℃的超聲波清洗機(jī)中提取30 min，考察酶解溫度對(duì)姜酚得率的影響。

1.3.4.3 酶解時(shí)間對(duì)姜酚得率的影響

準(zhǔn)確稱取5份粉碎干燥的生姜粉末，料液比1︰70（g/mL），纖維素酶添加量1.30%，酶解溫度45 ℃下分別酶解40，50，60，70和80 min，采用功率135 W、溫度60 ℃的超聲波清洗機(jī)中提取30 min，考察酶解時(shí)間對(duì)姜酚得率的影響。

1.3.4.4 超聲功率對(duì)姜酚得率的影響

準(zhǔn)確稱取5份粉碎干燥的生姜粉末，料液比1︰70（g/mL），纖維素酶添加量1.30%，溫度45 ℃下酶解60 min，功率分別為105，120，135，150和165 W，在溫度60 ℃的超聲波清洗機(jī)中提取30 min，考察超聲功率對(duì)姜酚得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面法試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取纖維素酶添加量（A）、酶解溫度（B）、酶解時(shí)間（C）、超聲功率（D）4個(gè)因素作為自變量，編碼水平為-1，0和1，以姜酚得率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，利用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)[13-15]。結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面分析的因素水平

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次測(cè)定，p＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Design-Expert 8.0.6，差異顯著性（p＜0.05）；趨勢(shì)線使用Microsoft Excel軟件計(jì)算繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 纖維素酶添加量對(duì)姜酚得率的影響

圖2為不同纖維素酶添加量對(duì)姜酚得率的影響。隨著加酶量增大，姜酚得率逐漸增大。因?yàn)槔w維素酶與生姜細(xì)胞壁上的纖維素的結(jié)合后結(jié)構(gòu)被破壞，更多的纖維素被水解或降解，增大細(xì)胞的通透性，提高姜酚得率。加酶量大于1.30%后，由于生姜細(xì)胞壁上的結(jié)合位點(diǎn)全部被酶分子占據(jù)達(dá)到飽和狀態(tài)，不會(huì)再加強(qiáng)酶解效果[16]。故選擇纖維素酶添加量1.30%為宜。

圖2 纖維素酶添加量對(duì)姜酚得率的影響

2.1.2 酶解溫度對(duì)姜酚得率的影響

圖3為不同酶解溫度對(duì)姜酚得率的影響。隨著溫度升高，姜酚得率逐漸增大。這是由于溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，有利于酚類物質(zhì)析出；但溫度高于45 ℃時(shí)得率增加幅度明顯減小，是因?yàn)橛幸掖紦]發(fā)，可能會(huì)破壞提取出的姜酚[17]。故選擇酶解溫度45 ℃為宜。

圖3 酶解溫度對(duì)姜酚得率的影響

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)姜酚得率的影響

圖4為不同酶解時(shí)間對(duì)姜酚得率的影響。隨著酶解時(shí)間增加，姜酚得率逐漸增大。是因?yàn)槊附鈺r(shí)間短，姜酚提取不充分；但酶解時(shí)間60 min后，延長酶解時(shí)間，可能由于長時(shí)間的浸泡分子結(jié)構(gòu)遭到破壞且有其他雜質(zhì)溶出導(dǎo)致姜酚的得率降低[18]。故選擇酶解時(shí)間60 min為宜。

2.1.4 超聲功率對(duì)姜酚得率的影響

圖5為不同超聲功率對(duì)姜酚得率的影響。隨著超聲功率增加，姜酚得率增大，這是由于適當(dāng)強(qiáng)度的超聲功率可以加快酶反應(yīng)。但功率過大時(shí)，超聲波的機(jī)械作用可使分子的運(yùn)動(dòng)速度增加、植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，會(huì)使生姜中其他組分被提取出來或?qū)⑻崛〕龅慕映煞制茐?，影響提取效果，?dǎo)致姜酚得率下降[19]，所以超聲功率大于135 W時(shí)得率增加幅度明顯減小。故選擇超聲功率135 W為宜。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)姜酚得率的影響

圖5 超聲功率對(duì)姜酚得率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 回歸模型方差分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇纖維素酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、超聲功率4個(gè)因素為自變量，姜酚得率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果如表2。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元擬合回歸分析得到姜酚得率（Y）的回歸方程：Y=1.90+0.076A-0.056B+0.030C-0.015D+0.01AB+0.018AC-0.035AD-0.020BC+2.500E-003BD+7.500E-003CD-0.13A2-0.069B2-0.090C2-0.083D2。

由表3可知，回歸方程的模型p＜0.01，說明該回歸方程極顯著。F值可以直觀地反應(yīng)各個(gè)因素對(duì)姜酚得率的影響大小，并且F值越大，則對(duì)響應(yīng)值的影響也越大。由表3得知，4個(gè)因素對(duì)姜酚得率影響大小的順序?yàn)槔w維素酶添加量＞酶解溫度＞酶解時(shí)間＞超聲功率。從表3還可以看出一次項(xiàng)A、B和二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2和一次項(xiàng)C對(duì)姜酚得率影響極顯著，交互項(xiàng)AD對(duì)姜酚得率影響顯著，其他因素不顯著。

表2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果

表3 二次回歸模型的方差分析

2.2.2 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

為進(jìn)一步探討纖維素酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、超聲功率對(duì)響應(yīng)值的影響，可視化分析各個(gè)因素之間的交互作用，回歸方程響應(yīng)面如圖6～8。隨著纖維素酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、超聲功率增大，姜酚得率呈現(xiàn)先升高再降低趨勢(shì)，與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致，響應(yīng)面圖都較陡峭且有最大值[20-21]。響應(yīng)面和等高線三維圖可用于解釋自變量之間的交互作用。從響應(yīng)面的陡峭程度可判斷兩因素對(duì)響應(yīng)值的作用是否顯著，一般響應(yīng)面越陡峭，說明兩因素交互作用越顯著[22-24]。

圖6 纖維素酶添加量及酶解溫度對(duì)姜酚得率交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

圖7 纖維素酶添加量及超聲功率對(duì)姜酚得率交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

圖8 酶解時(shí)間及酶解溫度對(duì)姜酚得率交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

從圖6可知，當(dāng)纖維素酶添加量一定時(shí)，姜酚得率隨著酶解溫度的增加呈現(xiàn)先升高后減降低的趨勢(shì)；酶解溫度一定時(shí)，姜酚得率隨著纖維素酶添加量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。等高線接近圓形，表明纖維素酶添加量與酶解溫度的交互作用不顯著，這與回歸方程方差分析的結(jié)果相符。

由圖7可知，纖維素酶添加量一定時(shí)，姜酚得率隨著超聲功率增加呈現(xiàn)先增大后減小趨勢(shì)；超聲功率一定時(shí)，姜酚得率隨著纖維素酶添加量增加呈現(xiàn)先增大后減小趨勢(shì)。通過對(duì)等高線形狀和響應(yīng)面的陡峭程度分析，等高線密集，且接近橢圓形，響應(yīng)面坡度較陡峭，可知纖維素酶添加量與超聲功率交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響顯著。

由圖8可知，酶解溫度一定時(shí)，姜酚得率隨著酶解時(shí)間增加呈現(xiàn)先增大后減小趨勢(shì)；酶解時(shí)間一定時(shí)，姜酚得率隨著酶解溫度增加呈現(xiàn)先增大后減小趨勢(shì)。響應(yīng)面坡度較小且等高線接近圓形，說明酶解溫度與酶解時(shí)間交互作用不顯著。因素交互的分析結(jié)果驗(yàn)證回歸模型方差分析結(jié)果。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過軟件Design-Expert 8.0.6分析得到最佳姜酚提取條件為纖維素酶添加量1.44%、酶解溫度42.91 ℃、酶解時(shí)間62.38 min、超聲功率132.67 W，在此條件下姜酚得率的理論值可達(dá)1.924 6%。出于對(duì)試驗(yàn)條件的可操作性考慮，進(jìn)一步將提取工藝條件修正為纖維素酶添加量1.30%、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間60 min、超聲功率135 W。經(jīng)3次驗(yàn)證性試驗(yàn)，姜酚得率為1.89%，與理論預(yù)測(cè)值相近，說明該響應(yīng)面結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

對(duì)超聲波輔助纖維素酶法提取生姜中姜酚的工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過單因素試驗(yàn)考察纖維素酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間和超聲功率4個(gè)因素對(duì)姜酚得率的影響，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析，結(jié)果表明纖維素酶添加量和酶解溫度對(duì)姜酚得率的影響極顯著，酶解時(shí)間影響顯著，而超聲功率不顯著。兩因素間的交互作用對(duì)姜酚得率影響較明顯的是纖維素酶添加量和超聲功率。優(yōu)化后的姜酚得率提取工藝為纖維素酶添加量1.30%、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間60 min、超聲功率135 W。在該條件下實(shí)際測(cè)得姜酚得率為1.89%，與理論預(yù)測(cè)值相近，說明試驗(yàn)所建立的回歸模型較為準(zhǔn)確，優(yōu)化方案合理可行。