曹鑫磊，姜浩,2，楊寶山，焦克芹，王惠*

(1.濟南大學 水利與環(huán)境學院，山東 濟南 250022；2.山東省生態(tài)環(huán)境規(guī)劃研究院，山東 濟南 250101)

納米銀(AgNPs)作為使用廣泛的納米材料之一，因其優(yōu)良的抑菌性能而被廣泛應用于紡織品、個人護理品、醫(yī)療器械、食品包裝材料等各類產(chǎn)品中[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，全球AgNPs用量占納米材料總用量的50%[3]，每年超過400 t的AgNPs被用于各種行業(yè)。AgNPs可通過多種途徑(污泥回田、噴灑殺蟲劑、污水灌溉等)進入農田土壤中，在歐美國家約有60%包含人工納米材料的污泥通過農業(yè)施肥進入農田，長期施用這些污泥必然導致農田土壤中人工納米材料的積累[4]。而作為一種新型污染物，AgNPs在土壤中的積累可改變土壤的pH、有機碳含量及礦質氮的含量[5]，并且釋放到環(huán)境中的AgNPs可通過微生物對環(huán)境營養(yǎng)循環(huán)過程產(chǎn)生影響，進而影響生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[6]。AgNPs對微生物的抑制作用主要歸因于其釋放的Ag+及其誘導產(chǎn)生的活性氧自由基所引發(fā)的蛋白失活、細胞膜破損、能量代謝受阻、DNA損傷等毒理效應。但在實際環(huán)境暴露過程中，AgNPs易受到天然有機物質、pH、溶解氧、陰/陽離子、光照等環(huán)境因素以及自身形貌、表面包埋劑等理化性質的影響，導致其出現(xiàn)溶解、團聚、沉淀等賦存狀態(tài)的改變，進而影響其微生物毒性[7]。因此，AgNPs在土壤中的積累與遷移轉化及其對土壤微生物的毒性影響已引起國內外學者的普遍關注。

土壤呼吸作用和酶活性作為土壤毒理學研究的重要參考指標，可以快速指示土壤系統(tǒng)中微生物活性和功能的變化趨勢。Shin等[8]發(fā)現(xiàn)，不同濃度的AgNPs處理土壤后，6種土壤酶(脫氫酶、FDA水解酶、脲酶、酸性磷酸酶、芳基硫酸酯酶和β-葡萄糖苷酶)活性均受到不同程度的抑制。Rahmatpour等[9]和王秋雙等[10]研究表明，中高濃度的AgNPs顯著抑制了土壤的呼吸作用。有關AgNPs對土壤微生物影響的研究指出，AgNPs可以顯著抑制土壤微生物的生長，改變土壤細菌和真菌的群落組成，并降低土壤微生物的多樣性[10-14]。Grün等[15]研究發(fā)現(xiàn)AgNPs對土壤中氨氧化菌和固氮菌會產(chǎn)生長期抑制作用，進而對土壤氮的循環(huán)過程造成不利影響。Samarajeewa等[12]和Sillen等[14]通過研究發(fā)現(xiàn)AgNPs會造成微生物活性和多樣性下降，導致微生物對不同碳源的利用效率下降。而且AgNPs對土壤微生物的作用也受其濃度、粒徑大小以及土壤性質的影響[16]。

最新的研究發(fā)現(xiàn)，土壤中添加有機改良劑可使土壤中腐殖酸含量升高，導致AgNPs對土壤微生物生物量的抑制作用增強[17]。而秸稈還田作為一種常見的農業(yè)土壤改良措施，能提高土壤肥力、增加土壤腐殖酸含量，使土壤性質發(fā)生改變[18-19]?？紤]到AgNPs對土壤微生物的作用會隨著秸稈還田對土壤性質的改變而發(fā)生變化，因此，探討其如何影響秸稈還田土壤中的土壤酶活性及微生物群落功能多樣性，對AgNPs的毒性管理具有重要意義。

基于此，本文采用室內模擬培養(yǎng)實驗，研究AgNPs對秸稈還田農田土壤中碳循環(huán)相關生態(tài)過程及微生物群落功能多樣性的影響。通過測試土壤呼吸作用，觀察纖維素酶、多酚氧化酶、過氧化物酶活性及微生物群落功能多樣性的變化，為AgNPs毒性影響評價提供基礎數(shù)據(jù)和實踐參考，豐富AgNPs對土壤微生物影響的基礎理論。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

AGS-WM1000 AgNPs溶液(上海滬正納米科技有限公司)，黃褐色液體，平均粒徑<15 nm，銀純度為99.99%，溶液pH (7.0 ± 0.5)。采集濟南地區(qū)小麥收割后的秸稈，帶回實驗室風干，粉碎并過2 mm篩網(wǎng)。實驗所使用的藥品純度均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

UV-5200紫外可見分光光度計(上海元析)；HBS-1096A Biolog Eco微孔板吸光值測定使用酶標儀(南京德鐵)。

1.1.2 土壤采集

土壤樣品采集自山東省濟南市長清區(qū)冬小麥-夏玉米輪作的農田，取樣深度為0～20 cm。使用容重盒采集土壤計算含水率及田間最大持水量，土壤樣品采集完成后迅速帶回實驗室，除去可見的植物根系、有機碎屑和石塊等雜質，充分混勻后過2 mm篩網(wǎng)，取樣測定土壤基礎理化性質，見表1。

表1 土壤理化性質

1.2 樣品制備

過篩混勻后的土壤在(25±3) ℃，黑暗條件下預培養(yǎng)2周以穩(wěn)定微生物活性。2周后添加小麥秸稈和AgNPs。實驗樣品設置為空白對照組(無添加，CK)、土壤+小麥秸稈組(SW)、土壤+小麥秸稈+AgNPs組(AgSW)，供試土壤中小麥秸稈的添加量為5 g/kg[20]，AgNPs添加量為100 mg/kg[10,12,14]，調節(jié)土壤含水量至田間最大持水量的45%，每種實驗組設置3份。每份試樣中裝有相當于1 kg干重的土壤。

1.3 指標測定

1.3.1 土壤呼吸作用測定

通過檢測土壤呼吸速率與CO2累積釋放量來檢測人工化學材料對土壤生物學活動的影響，已被廣泛應用于土壤污染的研究中[10]。

將3種處理的土壤(50 g干重)分裝于廣口瓶底部，保持土壤含水量為田間最大持水量的45%，放入裝有20 mL NaOH溶液(0.1 mol/L)的燒杯，旋緊瓶塞，用真空硅脂密封。廣口瓶置于(25±3)℃，黑暗條件的溫室中培養(yǎng)28 d，分別在第2、4、7、14、21、28 d取出NaOH溶液，用0.05 mol/L HCl進行反滴定，計算CO2釋放量和釋放速率，每次取樣后重新補充NaOH溶液[21]。

1.3.2 土壤酶活性測定

土壤微生物和土壤酶是影響土壤有機質分解和腐殖質形成的重要調節(jié)劑，土壤微生物為了滿足其生長過程中對碳的需求，會分泌大量具有碳轉化功能的酶來分解秸稈中的碳水化合物[22]。酶活性的變化可用來表征微生物對AgNPs的響應程度。

本文對土壤中的過氧化物酶、多酚氧化酶及纖維素酶活性進行測定。土壤過氧化物酶能氧化土壤有機質，其在土壤腐殖質形成過程中具有重要作用[23]。多酚氧化酶能夠把土壤腐殖質組分中芳香族化合物氧化成醌，醌與土壤中蛋白質、氨基酸、礦物等物質反應生成有機質，完成土壤芳香族化合物循環(huán)，促進土壤有機碳的累積及土壤腐殖化進程[23]。纖維素酶分解纖維素形成纖維二糖，最后形成葡萄糖，是外源有機質進入土壤碳循環(huán)的重要過程[24]。

3種處理的土壤在(25±3) ℃，黑暗條件下培養(yǎng)28 d，并于實驗的第1、7、28 d取樣測定土壤過氧化物酶、多酚氧化酶及纖維素酶活性。土壤多酚氧化酶和過氧化物酶活性采用鄰苯三酚比色法測定，其活性以2 h后1 g土壤中紫色沒食子素的質量表示。纖維素酶活性采用硝基水楊酸比色法測定，以72 h內10 g土壤生成葡萄糖的質量表示[24]。

1.3.3 微生物群落水平生理分析

微生物是土壤物質循環(huán)及能量流動的主要參與者。因此，研究AgNPs對土壤微生物群落功能變化的影響，對于了解AgNPs對土壤生態(tài)系統(tǒng)結構和功能的影響具有十分重要的意義。本研究采用微生物群落水平生理分析(microbial community level physiological profiling，CLPP)探究了AgNPs對土壤微生物群落功能多樣性的影響。

使用Biolog Eco微孔板，每塊微孔板有96個孔，包含有3種處理的試樣，每種實驗組有32孔(包括1個對照組孔和31個單一碳源孔)，除對照組孔僅有水與指示劑以外，其余31孔均裝有單一碳源和四唑氮藍染料。微生物利用單一碳源進行代謝發(fā)生氧化還原反應，使四唑氮藍染料變成紫色，根據(jù)每孔顏色變化程度可檢測微生物的代謝能力。每個混合土樣稱取相當于10 g烘干質量的新鮮土，加入含90 mL 0.85% NaCl無菌溶液的三角瓶中，封口后在搖床上震蕩(200 r/min)30 min，按10倍稀釋法用0.85% NaCl無菌溶液將其稀釋至原來的1/1000，稀釋液經(jīng)離心去除土壤后，上清液用于接種。接種懸浮液于Biolog Eco微孔板中，每孔150 μL，置于25 ℃暗箱培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)240 h，期間每24 h用酶標儀在590 nm處讀取吸光值。

土壤微生物群落Biolog Eco微孔板在培育過程中的整體變化過程使用平均孔顏色變化率(average well color development，AWCD)表示，其計算方法如式(1)[25-26]：

(1)

式中，I為平均孔顏色變化率；C為各反應孔的吸光值，R為對照孔的吸光值。

采用Biolog Eco微孔板培養(yǎng)120 h的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Shannon-Weiner多樣性指數(shù)(香農指數(shù))H表征土壤微生物群落多樣性，其計算如式(2)[25-26]：

(2)

豐富度指被微生物群落利用的基質的數(shù)量，若微孔的光密度值(O)大于0.25，則認為是陽性值，并計入微生物群落的豐富度S(即此類光密度值大于0.25的微孔個數(shù)總和)計算如式(3)[25-26]:

S=Oi≥0.25。

(3)

2 結果與分析

2.1 AgNPs對土壤呼吸的影響

本實驗利用土壤CO2釋放速率和總釋放量表征AgNPs對土壤微生物活性的影響，如圖1所示。結果表明AgNPs處理對土壤呼吸速率與CO2總釋放量產(chǎn)生抑制作用，表明100 mg/kg AgNPs可使土壤微生物活性降低。從第7 d開始，SW處理組的土壤呼吸速率均顯著高于CK處理組，這表明添加小麥秸稈增強了土壤的呼吸作用，第21 d兩者CO2釋放速率差值最大，SW組相比于CK組提升了9.9%。而與SW處理組相比，添加AgNPs顯著降低了土壤CO2釋放速率，這表明AgNPs抑制了土壤呼吸過程，且這種抑制作用在CO2總釋放量中體現(xiàn)更加明顯。在整個實驗周期內，AgSW處理組中CO2釋放總量相比于SW處理組降低了36.8%(圖1(b))。

圖1 AgNPs對秸稈還田土壤呼吸作用的影響Fig.1 Effect of AgNPs on respiration in wheat-straw-returned soil

Samarajeewa等[12]研究了AgNPs對沙壤土微生物呼吸作用的影響，發(fā)現(xiàn)AgNPs(> 49 mg/kg)抑制了土壤呼吸作用。Rahmatpour等[27]研究發(fā)現(xiàn)，當土壤中AgNPs含量較高(> 20 mg/kg)時，土壤呼吸作用也被明顯抑制，且劑量越高抑制作用越大，這些結果與本實驗結果一致。AgNPs對土壤呼吸的抑制作用可能歸因于AgNPs對微生物酶促過程、細胞功能和細胞核形成的負面影響[28-29]。土壤微生物可能表現(xiàn)出代謝功能障礙或者群落改變，導致微生物的繁殖降低、活性下降、呼吸作用減弱[30]。

2.2 AgNPs對土壤酶活性的影響

在添加小麥秸稈和AgNPs的條件下，土壤中過氧化物酶、多酚氧化酶及纖維素酶活性產(chǎn)生了不同的變化(圖2)。

注：a、b、c表示< 0.05水平的顯著性,字母不同表示顯著。圖2 AgNPs對秸稈還田土壤中過氧化物酶、多酚氧化酶及纖維素酶活性的影響Fig.2 Effect of AgNPs on peroxidase, polyphenol oxidase, and cellulase activities in wheat-straw-returned soil

SW處理中，由于添加了小麥秸稈，3種土壤酶活性均出現(xiàn)了不同程度的升高，其中纖維素酶活性受到的影響最大。相比于CK組，培養(yǎng)第7 d、第28 d，SW處理組的纖維素酶均顯著升高(圖2(c))。多酚氧化酶僅在第7 d受小麥秸稈影響活性顯著升高(圖2(b))，而在第1 d和28 d SW處理中，其活性雖有所升高但并未達到統(tǒng)計學顯著水平。過氧化物酶在3個取樣點的SW處理組中升高程度均未達到顯著水平。

AgSW處理組3種碳轉化酶的活性均較低，其中過氧化物酶對AgNPs影響最為敏感。實驗第1 d和第28 d，AgSW處理組的過氧化物酶活性相比SW組顯著降低了12.7%和25.1%(圖2(a))，這表明過氧化物酶對AgNPs較敏感，且AgNPs可以在短時間內對土壤有機質的氧化過程產(chǎn)生抑制，進而可能對土壤腐殖質形成過程產(chǎn)生負面影響。AgNPs對多酚氧化酶的影響出現(xiàn)在第7 d以后，酶活性相較于SW組，在第7 d和第28 d分別降低了8.0%和27.1%(圖2(b))。過氧化物酶和多酚氧化酶活性變化表明，AgNPs可抑制土壤有機質轉化和腐殖質的形成。纖維素酶活性受AgNPs的影響最小，在3個取樣時間點相較于SW組，活性分別降低了5.6%、14.3%和13.7%(圖2(c))。而纖維素酶活性的結果也表明AgNPs對纖維素分解過程產(chǎn)生了抑制。

Shin等[8]發(fā)現(xiàn)，在短期AgNPs暴露實驗中，不同濃度的AgNPs處理土壤后，參與土壤碳循環(huán)的β-葡萄糖苷酶活性受到抑制。彭程等[31]研究結果也表明，AgNPs抑制了β-葡萄糖苷酶和纖維二糖水解酶兩種參與碳循環(huán)酶的活性。本研究中對3種酶的研究結果同樣表明AgNPs抑制了土壤有機質轉化和腐殖質形成以及纖維素的分解過程，對土壤碳循環(huán)產(chǎn)生了抑制作用。有關納米金屬顆粒對分子生物學影響的研究表明，AgNPs對土壤酶產(chǎn)生抑制作用的原因可能是AgNPs通過滅活蛋白質或阻斷酶上的結合位點來抑制酶活性，也可能是由于其粒徑小，易進入微生物內部產(chǎn)生氧化應激，導致微生物死亡從而抑制酶的產(chǎn)生和釋放，進而對土壤中某些酶的活性產(chǎn)生影響[32]。

2.3 AgNPs對土壤微生物群落功能多樣性的影響

平均孔顏色變化率(AWCD)的測試結果表明(圖3)，暴露于AgNPs的樣品總是比CK組和SW組值更低。培養(yǎng)240 h后，與CK相比，SW處理組的AWCD增加了13.6%，AgSW處理組相比SW組則減少了73.8%。

圖3 3種不同處理土壤微生物群落AWCD隨時間的變化Fig.3 Changes in average well color development (AWCD) of the soil microbial community under three different treatments over time

從AWCD隨時間變化趨勢上可以發(fā)現(xiàn)，AgSW處理的AWCD值增長具有明顯的滯后性。而AWCD能夠表征微生物群落對不同碳源的利用能力，其值增長緩慢表明AgNPs導致土壤微生物群落功能多樣性發(fā)生了改變。這與Sillen等[12]的研究結果相同，其研究利用CLPP技術分析添加AgNPs后土壤中根際和非根際微生物群落的變化，發(fā)現(xiàn)含有AgNPs的樣品相較于對照組，AWCD升高緩慢，并且培養(yǎng)結束時AWCD值顯著低于對照組，表明AgNPs使土壤中根際和非根際微生物功能多樣性(碳源利用方式)發(fā)生了變化，導致土壤微生物群落功能多樣性和微生物的活性降低，這也解釋了本研究AWCD的變化結果。

由表2可知，AgSW處理組與SW處理組相比，微生物香農指數(shù)和群落豐富度顯著降低。雖然添加小麥秸稈使AWCD、香農指數(shù)和群落豐富度出現(xiàn)升高，但均未達到統(tǒng)計學顯著水平(表2)。

表2 不同處理土壤微生物群落多樣性指數(shù)

總體而言，CLPP的結果表明AgNPs使微生物多樣性與群落豐富度下降，土壤微生物群落功能多樣性顯著降低。該結果與Samarajeewa等[12]的研究結果一致，其研究發(fā)現(xiàn)AgNPs在49～1815 mg/kg的濃度范圍內對微生物生長、活性和多樣性產(chǎn)生負面影響。產(chǎn)生負面影響的原因可能與AgNPs引起的活性氧(ROS)氧化應激有關[33]，且AgNPs還可以通過與生物大分子反應或釋放Ag+等有毒成分來產(chǎn)生抑制作用。一般認為，AgNPs可通過直接接觸、誘導活性氧產(chǎn)生和釋放毒性離子等方式，造成膜損傷、DNA損傷和細胞信號受阻，進而影響微生物活性，對微生物群落功能多樣性產(chǎn)生影響[34]。

2.4 AgNPs對所測土壤指標影響的冗余分析

為了更加直觀地表達AgNPs對土壤呼吸作用、酶活性以及微生物的影響，采用Canoco 5.0對以上指標進行了冗余分析(redundancy analysis，RDA)，結果如圖4所示。RDA分析顯示第一和第二坐標軸累計貢獻率達到96.37%，且AgNPs與所測試的土壤指標均呈現(xiàn)明顯的負相關。受AgNPs負面影響最小的是土壤纖維素酶活性，而土壤呼吸速率、香農指數(shù)以及群落豐富度與AgNPs的負相關性最強。土壤呼吸速率、土壤酶活性均與微生物多樣性和群落豐富存在正相關關系。

圖4 AgNPs與測試指標間的冗余分析Fig.4 Comparative redundancy analysis of AgNPs and test indicators

3 結論

由于AgNPs在環(huán)境中排放持續(xù)增加，對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響必然是一個長期且復雜的過程。本研究初步闡釋了100 mg/kg AgNPs短期內對秸稈還田土壤呼吸速率、土壤酶活性及微生物群落功能多樣性的影響。

(1)在短期培養(yǎng)中AgNPs抑制秸稈還田土壤的呼吸作用，具體表現(xiàn)為土壤CO2釋放速率降低以及累積CO2釋放量減少(36.8%)。

(2)AgNPs污染土壤后，3種碳循環(huán)相關土壤酶活性出現(xiàn)了不同程度的降低，其中過氧化物酶活性受AgNPs影響最大，多酚氧化酶次之，而纖維素酶活性受影響最小。

(3)CLPP分析的結果顯示，AgSW處理組AWCD值、香農指數(shù)及微生物群落豐富度顯著降低。AgNPs減少了土壤中微生物多樣性和群落豐富度，降低了微生物群落功能多樣性。

雖然CLPP技術可以準確、可靠地反映和比較微生物群落對AgNPs的響應，可用于研究不同環(huán)境條件下微生物群落功能的變化，但不能全面評價土壤微生物在不同分類單元上的差異，之后需要通過更加全面的土壤微生物分析技術，例如高通量測序和土壤官能團分析技術進行更深入、更有針對性的研究。