范國鑫，馮贊杰，彭慈軍，張世龍，段玉靈，李凱

1遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州遵義563000；2遵義醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室

肝臟缺血—再灌注損傷（HIRI）是指缺血肝臟在恢復(fù)血液灌注后破壞的結(jié)構(gòu)和功能不僅沒有恢復(fù)反而加重的現(xiàn)象。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是推動(dòng)HIRI發(fā)生發(fā)展的重要因素。目前HIRI是制約肝外科手術(shù)發(fā)展的重要原因之一［1-2］。HIRI保護(hù)研究主要包括藥物預(yù)處理、缺血預(yù)處理等，其中中藥預(yù)處理是目前研究的熱點(diǎn)。杜仲皮在我國已有2 000多年藥用歷史，是名貴滋補(bǔ)藥材，主要功效包括增強(qiáng)免疫力、抗癌、抗病毒、抗氧化、抗肝纖維化、抗炎等［3-4］，杜仲皮提取物能否通過抗氧化抗炎作用發(fā)揮對(duì)HIRI的保護(hù)作用，目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。因不同提取方式所提的杜仲皮提取物成分不同，其效用也可能不同。2019年12月—2020年9月，我們觀察了杜仲皮水提取物及醇提取物灌胃大鼠肝臟缺血再灌注處理后肝臟的損傷情況；并檢測了不同劑量的杜仲皮水提取物及醇提取物預(yù)處理后，大鼠肝組織中的炎癥反應(yīng)指標(biāo)（IL-1β、TNF-α）、氧化應(yīng)激指標(biāo)［總超氧化物歧化酶（SOD）、脂質(zhì)氧化酶（MDA）］及Caspase3蛋白，以探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物、試劑及儀器雄性SPF級(jí)SD大鼠64只，（200±20）g，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0011。飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。杜仲皮購自遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科。MDA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；SOD測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；水合氯醛購自北京麥瑞博生物科技有限公司。干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司），恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司），全波長酶標(biāo)儀（ther‐mo，美國），高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司），生物顯微鏡（leica，德國）。

1.2 杜仲皮水提取物及醇提取物的提取杜仲皮水提取物及醇提取物制作方法參照高銀輝等［5］方法進(jìn)行，水提取物提取方法為8倍質(zhì)量雙蒸水浸泡藥材2 h后，加熱回流煮沸2 h后抽取溶劑，過濾，相同步驟重復(fù)一次，合并兩次濾液過濾濃縮后放入4℃冰箱備用。杜仲皮醇提取物除溶劑換為60%乙醇外其余提取步驟相同，濃縮至無醇味，用于后續(xù)灌胃。

1.3 大鼠分組、杜仲皮水提取物及醇提取物灌胃、肝臟缺血再灌注處理64只雄性SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為8組（假手術(shù)組，HIRI組，水提取物高、中、低劑量組，醇提取物高、中、低劑量組），每組8只。假手術(shù)組、HIRI組使用雙蒸水進(jìn)行灌胃，水提取物及醇提取物高、中、低劑量組使用杜仲皮水提取物及醇提取物灌胃，杜仲皮水提取物及醇提取物高、中、低劑量使用濃度均為80 g生藥/（kg·d）、40 g生藥/（kg·d）、20 g生藥/（kg·d）。各組均連續(xù)灌胃10 d。使用10%水合氯醛（400 mg/kg）麻醉大鼠后，除假手術(shù)組外其余各組均用顯微止血夾阻斷肝中葉及左肝葉血流造成大鼠70%肝臟缺血，缺血時(shí)間為1 h，再灌注時(shí)間為4 h，假手術(shù)組開腹后僅解剖十二指腸韌帶。

1.4 血清ALT、AST的檢測各組大鼠于再灌注4 h時(shí)（假手術(shù)組開腹5 h時(shí)），麻醉下頸椎脫臼法處死大鼠，下腔靜脈取血室溫放置2 h后4℃1 000×g離心15 min，取上清（血清）存放于–80℃冰箱備用，由遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科使用全自動(dòng)生化儀檢測血清ALT、AST。

1.5 肝組織病理學(xué)觀察及IL-1β、TNF-α、MDA、SOD的檢測各組大鼠均取左肝葉，部分肝臟使用10%中性甲醛固定24 h后送由遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科制作切片及HE染色，其余部分存放于–80℃冰箱。采用ELISA法檢測肝組織中TNF-α、IL-1β；硫代巴比妥酸法測定肝組織中MDA；黃嘌呤氧化酶法檢測肝組織中SOD。

1.6 肝組織Caspase3蛋白的檢測HIRI組、水提取物高劑量組、假手術(shù)組大鼠取肝臟組織加入組織重量9倍的0.86%預(yù)冷生理鹽水，在SCIENTZ-48高通量組織研磨器中充分研磨（15 000 r/min，10 s，5次），離心10 min（4℃，13 000 r/min），吸取上清液（肝勻漿）用于后續(xù)檢測或-80℃保存。Westernblotting法檢測肝組織中Caspase3蛋白。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較，方差齊使用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊使用Dunnett，sT3檢驗(yàn)；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠病理學(xué)觀察結(jié)果及血清ALT、AST水平比較各組大鼠肝臟HE染色結(jié)果如圖1，假手術(shù)組（圖1A）肝索排列整齊，肝細(xì)胞大小形態(tài)正常；HIRI組（圖1B）肝索排列紊亂，部分肝細(xì)胞明顯壞死；水提取物高、中、低劑量組（圖1 C、圖1D、圖1E）及醇提取物高、中、低劑量組（圖1F、圖1G、圖1H）肝索排列紊亂及肝細(xì)胞壞死程度均較HIRI組減輕。

與假手術(shù)組比較，HIRI組血清ALT、AST水平升高（P均＜0.05）；與HIRI組比較，水提取物及醇提取物高、中、低劑量組AST、ALT水平降低（P均＜0.05）。水提取物及醇提取物高劑量組AST、ALT水平低于水提取物及醇提取物中、低劑量組（P均＜0.05）。水提取物高劑量與醇提取物高劑量組AST水平比較，P＜0.05；ALT水平比較，P＞0.05。各組大鼠血清ALT、AST水平見表1。

2.2 各組肝組織中IL-1β、TNF-α、MDA、SOD水平比較與假手術(shù)組比較，HIRI組肝組織IL-1β、TNF-α水平升高（P均＜0.05）；與HIRI組比較，水提取物及醇提取物高、中、低劑量組IL-1β、TNF-α水平降低（P均＜0.05）。水提取物及醇提取物高劑量組IL-1β、TNF-α水平低于水提取物及醇提取物中、低劑量組（P均＜0.05）。水提取物高劑量與醇提取物高劑量組TNF-α水平比較，P＜0.05；IL-1β水平比較，P＞0.05。與 假 手術(shù) 組 比 較，HIRI組 肝組 織MDA、SOD水平升高（P均＜0.05）；與HIRI組比較，水提取物及醇提取物高、中、低劑量組MDA水平降低、SOD水平升高（P均＜0.05）。水提取物高、中、低劑量組MDA、SOD水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05），但具有濃度依賴趨勢。醇提取物高劑量組MDA水平低于醇提取物中、低劑量組，醇提取物高劑量組SOD水平高于醇提取物中、低劑量組，（P均＜0.05）。水提取物高劑量與醇提取物高劑量組MDA水平比較，P＜0.05；SOD水平比較，P＜0.05。各組大鼠肝組織中IL-1β、TNF-α、MDA、SOD詳見表2。

圖1 電鏡下各組大鼠肝臟組織表現(xiàn)（HE染色，×20）

表1 各組大鼠血清ALT、AST水平（±s）

表1 各組大鼠血清ALT、AST水平（±s）

組別水提取物高劑量組水提取物中劑量組水提取物低劑量組醇提取物高劑量組醇提取物中劑量組醇提取物低劑量組HIRI組假手術(shù)組n 8 8 8 8 8 8 8 8 ALT（U/L）411.83±102.31 724.57±131.23 747.75±105.45 426.14±278.00 1 242.17±250.47 1 058.33±192.44 1 871.00±248.09 147.25±57.21 AST（U/L）354.67±165.95 745.14±186.78 764.75±170.39 936.29±148.23 1 145.33±187.45 1 164.00±156.50 1 521.75±133.82 45.75±22.23

2.3 各組Caspase3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較水提取物高劑量組、HIRI組、假手術(shù)組Caspase3蛋白相對(duì)表 達(dá)量分 別為0.98±0.12、1.31±0.20、0.80±0.14。與假手術(shù)組相比，HIRI組Caspase3蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；與HIRI組相比，水提取物高劑量組Caspase3蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05），各組Caspase3蛋白相對(duì)表達(dá)量見圖2。

表2 各組大鼠肝組織中IL-1β、TNF-α、MDA、SOD水平（±s）

表2 各組大鼠肝組織中IL-1β、TNF-α、MDA、SOD水平（±s）

組別水提取物高劑量組水提取物中劑量組水提取物低劑量組醇提取物高劑量組醇提取物中劑量組醇提取物低劑量組HIRI組假手術(shù)組n 8 8 8 8 8 8 8 8 IL-1β（ng/L）67.73±15.00 75.42±16.28 94.45±22.97 73.42±18.66 88.61±13.69 102.44±21.83 123.33±15.45 49.12±9.17 TNF-α（ng/L）250.82±31.52 289.55±33.93 319.75±33.30 285.76±20.99 299.49±30.08 323.54±25.31 438.55±27.30 203.60±43.47 MDA（μmol/gprot）0.18±0.02 0.20±0.03 0.21±0.05 0.21±0.03 0.33±0.08 0.35±0.06 0.58±0.10 0.19±0.05 SOD（U/mgprot）232.62±17.92 215.31±7.66 217.79±18.69 211.32±14.68 189.14±13.68 183.18±16.86 184.20±19.13 251.18±23.35

圖2 HIRI組、水提取物高劑量組、假手術(shù)組Caspase3蛋白電泳圖（Western-blotting法）

3 討論

隨著肝外科手術(shù)的精細(xì)化和復(fù)雜化，多數(shù)肝臟手術(shù)都需要暫時(shí)阻斷肝臟血流，HIRI成為影響患者肝臟手術(shù)預(yù)后的重要因素［5-6］?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，HIRI發(fā)生發(fā)展機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，主要涉及到的機(jī)制包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線粒體功能紊亂、Kupffer細(xì)胞激活、血管細(xì)胞黏附分子過表達(dá)等［7-8］。

杜仲作為我國特有的藥用植物，針對(duì)杜仲皮的藥用研究表明杜仲皮具有抗炎、抗氧化作用，而氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)是缺血—再灌注損傷的兩個(gè)重要環(huán)節(jié)。已有研究表明，杜仲皮提取物可以通過降低機(jī)體氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)水平起到對(duì)腦缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用［9］肝臟組織病理學(xué)檢查是判斷肝臟結(jié)構(gòu)損傷的金標(biāo)準(zhǔn)，而ALT、AST測定可以很好地反映肝臟功能損傷情況。MDA和SOD是反映機(jī)體氧化應(yīng)激情況的兩個(gè)重要指標(biāo)，MDA是機(jī)體的氧化產(chǎn)物，生成量與細(xì)胞受損程度成正比，而SOD反映機(jī)體對(duì)自由氧的清除能力，與細(xì)胞氧化損傷程度成反比。IL-1β、TNF-α是反映機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，杜仲皮水提取物及醇提取物可以對(duì)HIRI起到防治作用，可能是通過減少M(fèi)DA生成，升高SOD水平減輕HIRI氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低IL-1β、TNF-α減輕炎癥反應(yīng)以及改善肝臟結(jié)構(gòu)和功能損傷而實(shí)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，水提取物高劑量組MDA、TNF-α、AST水平低于醇提取物高劑量組，SOD水平高于醇提取物高劑量組，此外除醇提取物低劑量組外，其余提取物預(yù)處理組MDA水平和假手術(shù)組相比差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示杜仲皮提取物在降低MDA水平方面具有較強(qiáng)作用。研究還發(fā)現(xiàn)，給藥劑量越高其防治作用越強(qiáng)，水提取物高劑量組Cas‐pase3蛋白表達(dá)水平明顯降低，提示水提物通過抑制細(xì)胞凋亡途徑起到對(duì)HIRI的保護(hù)作用。但各組杜仲皮提取物在升高肝臟SOD水平方面并未呈現(xiàn)出如降低MDA水平般效果，經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)杜仲皮提取物除可以升高SOD水平外，同時(shí)也升高谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平，GSH-Px也是機(jī)體清除氧自由基的重要蛋白［10］。杜仲皮提取物在HIRI中降低MDA水平的能力可能是由SOD及GSHPx共同介導(dǎo)。由于提取工藝不同，水提取物和醇提取物中所含成分并不一致，杜仲皮提取物主要含有總多糖和總黃酮，多糖易溶于水，總黃酮易溶于醇。有研究表明杜仲多糖可以明顯降低氧化應(yīng)激水平［11-12］。此外，陳玉甫等［13］通過比較杜仲皮醇提取物及水提取物中桃葉珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸與綠原酸四種主要活性成分發(fā)現(xiàn)，醇提取物中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸與綠原酸含量高于水提取物，但差值不到1倍，而京尼平苷在水提取物中含量約為醇提取物中含量的5倍。有研究報(bào)道京尼平苷具有較強(qiáng)抗氧化能力，可以通過降低氧化應(yīng)激水平減輕大鼠心肌再灌注損傷［14］，因此，我們推測水提取物發(fā)揮更好的保護(hù)作用可能和含有較高濃度多糖及京尼平苷有關(guān)。

綜上所述，杜仲皮提取物可減輕氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)，改善大鼠HIRI，保護(hù)效應(yīng)呈劑量相關(guān)性，且水提取物的保護(hù)作用優(yōu)于醇提取物；另外，本研究發(fā)現(xiàn)杜仲皮水提物可減少HIRI過程中Cas‐pase3表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，但其具體機(jī)制仍不明確，需進(jìn)一步深入研究。