周男 遲增鵬 李文健 趙開 王少如 王奇民 童磊 何宗軒 韓紅鈺 王瑩 陳正崗

1.濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，濰坊261021；2.大連醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，大連116044；3.青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，青島266003；4.青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，青島266071；5.青島大學(xué)附屬醫(yī)院口腔頜面外科，青島266005；6.濟(jì)南市第四人民醫(yī)院口腔科，濟(jì)南250031

舌鱗狀細(xì)胞癌（tongue squamous cell carcino‐ma，TSCC）是最常見、最惡性的口腔癌之一，生存率低、發(fā)病率高，并且年輕患者發(fā)病率呈上升的趨勢(shì)[1]，其具有很強(qiáng)的快速局部轉(zhuǎn)移和侵襲的傾向[2]，患者經(jīng)系統(tǒng)治療后預(yù)后較差[3]。目前，TSCC的治療主要采用手術(shù)、放療和化療相結(jié)合的綜合治療模式。隨著基礎(chǔ)研究發(fā)展，各種腫瘤生物治療方法，尤其是靶向治療技術(shù)發(fā)展較快。

Rho 蛋白是小GTPase 的Ras 超家族成員，其功能是二磷酸鳥苷（guanosine diphosphate，GDP）和三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）調(diào)節(jié)的開關(guān)[4-5]?；钚缘腞hoGTPases 能與下游效應(yīng)子結(jié)合，刺激控制肌動(dòng)蛋白重組并調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀、極性、動(dòng)力、黏附以及信號(hào)通路等多種功能[6]。Rho蛋白的羧基端有CAAX序列（其中C代表半胱氨酸，A是脂肪族氨基酸，X 是末端任意氨基酸），Rho 蛋白的活化和定位是通過CAAX 序列的翻譯后修飾決定的。首先進(jìn)行半胱氨酸殘基的異戊二烯化，然后進(jìn)行AAX 序列的蛋白水解。異戊二烯基半胱氨酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶（isoprenylcysteine car‐boxylmethyltransferase，ICMT） 參與翻譯后修飾的最后一步，即催化異戊烯化半胱氨酸的羧基甲基化，這種翻譯后修飾對(duì)維持信號(hào)蛋白的正常功能具有重要意義[7]。Ras超家族的GTPase 家族成員幾乎都含有CAAX 基序，其中Rho 家族與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[8-9]，而ICMT 可調(diào)節(jié)RhoGTPases（如RhoA、Rac1）的正確膜定位和活性[10]。因此，抑制CAAX蛋白翻譯后甲基化的酶ICMT是腫瘤治療的一個(gè)有希望的靶點(diǎn)。本研究通過探討IC‐MT 對(duì)人 TSCC CAL-27 和 SCC-4 細(xì)胞遷移及侵襲的影響及相關(guān)通路，為其的靶向治療提供一定的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

人TSCC 細(xì)胞系CAL-27 購于中南大學(xué)高等研究中心，人SCC-4 細(xì)胞系由山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng)，Dulbecco’s改良培養(yǎng)基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶（Gibco公司，美國），胎牛血清（BI公司，以色列），青霉素、鏈霉素（Gibco 公司，美國），TB Green Premix Ex TadTM試劑盒（TAKARA 公司，日本），實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reac‐tion，PCR）引物ICMT、RhoA、磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAP‐DH）合成（上海生工生物工程有限公司），小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）片段設(shè)計(jì)、合成、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（廣州銳博生物科技有限公司）。兔抗人多克隆抗體ICMT（Proteintech 公司，美國），兔抗人多克隆抗體RhoA、基質(zhì)金屬蛋 白 酶 （matrix metalloproteinase， MMP） -2、MMP-9（Abcam 公司，英國），兔抗人多克隆抗體Rho 關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋結(jié)合蛋白激酶1（recombinant Rho associated coiled coil containing protein kinase 1，ROCK1）、GAPDH（CST 公司，美國），羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗（CST 公司，美國），細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Tran‐swell小室（Corning公司，美國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

CAL-27 和 SCC-4 細(xì)胞于 5 mL 含 10% 胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（25 cm2）中培養(yǎng)，放置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中。瓶底細(xì)胞長至約90%后，棄原培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗，加入1 mL 胰蛋白酶置于37 ℃環(huán)境下消化3~5 min，顯微鏡下觀察到細(xì)胞間隙增大，胞質(zhì)回縮后立即加入等量的含血清培養(yǎng)基終止消化，按順序吹打瓶底細(xì)胞，避免出現(xiàn)氣泡，將細(xì)胞懸液吸取至 15 mL 離心管中 1 000 r·min-1離心 5 min，棄上清，向離心管中加入10 mL 培養(yǎng)基，反復(fù)吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，按1∶2的比例傳代至新培養(yǎng)瓶中。

1.3 siRNA轉(zhuǎn)染

構(gòu)建3 條針對(duì)ICMT 基因序列的特異性ICMT-siRNA（表1）和1 條陰性序列作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染分組分為實(shí)驗(yàn)組（細(xì)胞轉(zhuǎn)染ICMT-siRNA），空白組（細(xì)胞僅加轉(zhuǎn)染試劑，不轉(zhuǎn)染siRNA），陰性對(duì)照組（細(xì)胞轉(zhuǎn)染無關(guān)siRNA 序列）。轉(zhuǎn)染前1 d 將對(duì)數(shù)生長期的 CAL-27 和 SCC-4 細(xì)胞以每孔 5×105個(gè)的密度接種于6 孔板，細(xì)胞密度長至30%~50%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染48 h后，檢測(cè)基因的表達(dá)。

表 1 針對(duì)ICMT基因序列設(shè)計(jì)3條ICMT-siRNATab 1 Three ICMT-siRNA sequences designed for IC‐MT gene

1.4 qRT-PCR檢測(cè)各組ICMT、RhoA的mRNA表達(dá)

每組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，分別提取各組細(xì)胞的總RNA，并使用紫外光分光光度計(jì)以測(cè)定RNA 的含量。反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），以此cDNA為模板行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。GAPDH為內(nèi)參照。ICMT引物序列：上游5’-CGGCATCCTTCTTACGTCGG-3’，下游5’-CCACACTGTCAGGGCATAGC-3’；RhoA 引物序列：上游 5’-TGTGGCAGATATCGAGGTGGATGG-3’，下游5’-GGCCTCAGGCGATCATAATCTTCC-3’；GAPDH引物序列：上游5’-GCACCGTCAAGGCTGAGA‐AC-3’，下游5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，然后 95 ℃ 5 s，60 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。由ABIPRISM 7000 熒光定量PCR 儀完成自動(dòng)熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)及數(shù)據(jù)分析。利用 2-ΔΔCt公式計(jì)算 mRNA 相對(duì)表達(dá)量，其中 ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因、ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組，Ct 值即循環(huán)閾值。根據(jù)ICMT 的mRNA 的表達(dá)明確沉默效率以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)蛋白的表達(dá)

提取轉(zhuǎn)染48 h 后的各組細(xì)胞的總蛋白以及膜蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。100 ℃下變性5 min，每泳道等量上樣50 μg 蛋白用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳后用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉PVDF 膜1 h 后，加入一抗（ICMT，1∶1 000；RhoA，1∶5 000；ROCK1，1∶1 000；MMP-2，1∶1 000；MMP-9，1∶1 000；GAPDH，1∶5 000），4 ℃過夜。用三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水 （triethanolamine buffered saline，TBST） 洗膜后與IgG 二抗（1∶50 000）室溫孵育2 h，再用TBST 洗膜3 次，電化學(xué)發(fā)光法顯色、曝光。用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

將已鋪好基質(zhì)膠的Transwell 小室置于24 孔板，上室與下室分別加入500 μL 無血清培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱水化2 h。已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞消化、離心后，PBS 沖洗，加入無血清培養(yǎng)基重懸成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)使密度調(diào)整為每毫升3×105個(gè)，上室加入 500 μL 細(xì)胞懸液，下室加入 750 μL 含血清培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱48 h 取出，PBS 沖洗，干棉簽輕擦去上室未遷細(xì)胞，PBS沖洗。甲醛室溫固定30 min，吸干固定液，0.1%結(jié)晶紫染色30 min。PBS 沖洗，置顯微鏡下觀察拍照，隨機(jī)選取5個(gè)不同視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)，用200 μL 槍頭在中央沿直尺垂直劃痕。PBS沖洗3次，加無血清培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，于顯微鏡下分別觀察0、24、48 h 的劃痕愈合情況并拍照，計(jì)算24 h 及48 h 的相對(duì)愈合面積，即0 h 劃痕面積分別減去24、48 h 的劃痕面積，其差值分別除以0 h劃痕面積。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 22.0 軟件分析各組結(jié)果，計(jì)量資料兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICMT、RhoA的mRNA表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染ICMT-siR‐NA 后實(shí)驗(yàn)組ICMT 的mRNA 表達(dá)水平明顯下降（P<0.05）。各實(shí)驗(yàn)組mRNA 表達(dá)量相比，ICMT-siRNA-1 和ICMT-siRNA-3 兩組沉默效率較高，作為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行下一步研究。RhoA 的mRNA 表達(dá)各組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖1）。

2.2 蛋白的表達(dá)水平變化

蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組ICMT蛋白表達(dá)水平明顯下降（P<0.05），RhoA 蛋白各組表達(dá)水平無明顯改變（P>0.05）；實(shí)驗(yàn)組RhoA膜蛋白表達(dá)水平明顯下降（P<0.05），ROCK1蛋白表達(dá)下降（P<0.05），MMP-2、MMP-9 的表達(dá)降低（P<0.05）（圖2、3）。

2.3 ICMT-siRNA對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示（圖4），24、48 h 的實(shí)驗(yàn)組相對(duì)愈合面積均明顯小于空白、陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明細(xì)胞的遷移能力降低。

2.4 ICMT-siRNA對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)示（圖5），轉(zhuǎn)染48 h后實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯低于空白、陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明細(xì)胞侵襲能力降低。

圖 1 轉(zhuǎn)染ICMT-siRNA后ICMT、RhoA mRNA的表達(dá)Fig 1 Expression of ICMT and RhoA mRNA after ICMT-siRNA transfection

圖 2 CAL-27細(xì)胞轉(zhuǎn)染ICMT-siRNA后蛋白的表達(dá)Fig 2 The Expression of protein after ICMT-siRNA transfection of CAL-27 cells

圖 3 SCC-4細(xì)胞轉(zhuǎn)染ICMT-siRNA后蛋白的表達(dá)Fig 3 The Expression of protein after ICMT-siRNA transfection of SCC-4cells

圖 4 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果 倒置相差顯微鏡 ×40Fig 4 The results of scratch test inverted phase contrst microscope × 40

圖 5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果 倒置相差顯微鏡 ×100Fig 5 The results of Transwell invasion assay inverted phase contrast microscope ×100

3 討論

口腔癌是全球的第六大惡性腫瘤，近90%的口腔癌為口腔鱗狀細(xì)胞癌。TSCC 約占原發(fā)性口腔鱗狀細(xì)胞癌的30%，隨著年齡的增長和臨床分期的增加，生存率逐漸下降[11]。局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是死亡的主要原因，因此探討促進(jìn)其浸潤和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制很有必要。

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾在細(xì)胞生物學(xué)的許多方面起著至關(guān)重要的作用。ICMT 作為一種翻譯后修飾的酶，主要修飾CAAX 蛋白，包括小GTPase，如Ras和Rho蛋白[12]。ICMT 的甲基化對(duì)Ras和Rho蛋白在細(xì)胞中的正確膜定位和活化至關(guān)重要。Rho蛋白能夠通過影響肌動(dòng)球蛋白聚合和收縮、細(xì)胞黏附等來調(diào)控細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)[13]。有研究[14]表明，當(dāng)ICMT 活性降低時(shí)，影響Rho 蛋白甲基化，RhoGDI 與Rho 蛋白的結(jié)合親和力增強(qiáng)從而削弱了RhoGTP 結(jié)合和激活Rho 蛋白的能力，從而抑制Rho 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和Rho 蛋白介導(dǎo)的生物學(xué)行為，該研究明確了ICMT催化的甲基化在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用。

RhoA 是Rho 家族的一個(gè)成員，在乳腺癌、胃癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌和宮頸癌中高表達(dá)[15-20]。對(duì)鼻咽癌的研究[21]表明，抑制ICMT 可抑制鼻咽癌細(xì)胞的RhoA 活性，從而抑制RhoA 介導(dǎo)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。并且有研究[22]發(fā)現(xiàn)，抑制ICMT 甲基化減少了高轉(zhuǎn)移MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞系的侵襲和遷移，其影響歸因于RhoA 功能受損，從而進(jìn)一步闡明了甲基化在RhoGTPases功能中的作用。此外還有研究[23-24]證實(shí)，ICMT 在肺癌、胰腺癌中發(fā)揮重要作用，但其對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的影響尚未見相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)將ICMT-siRNA 轉(zhuǎn)染至TSCC CAL-27和SCC-4 細(xì)胞中沉默ICMT 基因，從而降低了IC‐MT 蛋白的表達(dá)，RhoA 蛋白表達(dá)無明顯改變，但RhoA 膜蛋白的表達(dá)降低，細(xì)胞的遷移和侵襲能力降低，推測(cè)ICMT 可能通過影響RhoA 的甲基化和膜定位以降低RhoA 活性來影響TSCC 細(xì)胞的遷移和侵襲，但并不影響RhoA 的表達(dá)，推測(cè)ICMT 基因與舌癌的遷移和侵襲有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)ICMT表達(dá)降低后RhoA 下游蛋白R(shí)OCK1 表達(dá)降低，MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量降低。

Rho 關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋結(jié)合蛋白激酶（ROCK1和ROCK2），也是絲氨酸/蘇氨酸激酶，是結(jié)合活性RhoA 的最佳效應(yīng)蛋白。ROCK 的激活可能導(dǎo)致不同的細(xì)胞事件，特別是細(xì)胞骨架的變化，影響細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-基質(zhì)黏附和細(xì)胞遷移[25]。有研究[26]報(bào)道，RhoA 定位在細(xì)胞膜上，在那里它可以被激活，并通過向ROCK 和肌動(dòng)球蛋白發(fā)出信號(hào)來促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移。RhoA 還可通過ROCK 信號(hào)通路參與血管內(nèi)皮生成因子誘導(dǎo)的腫瘤血管生成，并能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞透過脈管內(nèi)皮從而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[27]。本實(shí)驗(yàn)通過沉默ICMT 基因，抑制了RhoA的甲基化使RhoA 未能正確定位于細(xì)胞膜而活性降低，ROCK1 表達(dá)量降低，推測(cè)ICMT 影響TSCC遷移及侵襲可能與RhoA-ROCK信號(hào)通路有關(guān)。

腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲需要改變細(xì)胞和細(xì)胞基質(zhì)的黏附和重塑細(xì)胞外基質(zhì)。MMP 一個(gè)龐大的蛋白酶家族，它能降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，在腫瘤的發(fā)生、生存、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要作用，尤其是MMP-2 和MMP-9，在多種腫瘤中發(fā)揮作用[28]，能降解Ⅳ型膠原，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和加速新的毛細(xì)血管生成的作用。在TSCC中，由于其腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移率高，死亡率也較高，MMP-2和MMP-9的表達(dá)與TSCC 的早期診斷、局部復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和生存率有關(guān)，因此可作為患者預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)潛力的指標(biāo)[29]。本實(shí)驗(yàn)中，抑制ICMT 表達(dá)后，MMP-2 和MMP-9 表達(dá)降低，遷移侵襲能力下降，推測(cè)ICMT 通過參與對(duì)RhoA 等蛋白的翻譯后修飾，降低了蛋白活性，間接影響舌癌的遷移及侵襲。

綜上所述，ICMT-siRNA 可以抑制ICMT 的表達(dá)，從而抑制RhoA 的甲基化，使細(xì)胞膜上RhoA的表達(dá)降低，降低了其活性，而不改變胞內(nèi)RhoA蛋白的總量。RhoA 下游ROCK1 表達(dá)降低，推測(cè)這可能與RhoA-ROCK 通路受到抑制有關(guān)。MMP-2和MMP-9的表達(dá)降低，也證實(shí)了TSCC細(xì)胞的遷移侵襲能力的下降。因此，ICMT 在TSCC 細(xì)胞遷移、侵襲中可能發(fā)揮了重要作用，有望成為治療TSCC 的有效靶點(diǎn)，但其具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。