張嘉嘉,陳 濤,鮑 文,許 文,徐 偉,林 羽,張 勛
(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州350122)
金線蓮為蘭科開唇蘭屬植物花葉開唇蘭[Anoectochilus roburghii(Wal1.)Lindl]的干燥 全草,主要分布在我國的福建、浙江、廣西、云南等地區(qū),主要用于治療高血壓、糖尿病、心臟病、肺炎、急慢性肝炎、腎炎等疾病[1-2]。金線蓮主要成分為黃酮、金線蓮苷、多糖、核苷,其中黃酮類被認(rèn)為是金線蓮的重要有效成分,具有抗癌、保肝、抗菌、降血糖、抗氧化等多種功效[3-5]?!陡=ㄊ≈兴幉臉?biāo)準(zhǔn)2006年版》[6]《福建省中藥飲片炮制規(guī)范2012年版》[7]和《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范2005年版》[8]收載藥用金線蓮藥材及飲片,檢查項(xiàng)目包括水分、灰分、顯微鑒別和薄層鑒別,無含量測(cè)定項(xiàng)。已有文獻(xiàn)報(bào)道金線蓮中含有蘆丁、水仙苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素和異槲皮苷等6種黃酮[9],其中水仙苷的含量最高,因此,本文以水仙苷為指標(biāo),建立高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定福建金線蓮水仙苷的含量,考察方法耐用性和可靠性,以期為金線蓮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供科學(xué)依據(jù)。
1.1 儀器 Agilent 1290高效液相色譜儀、G4212A 1290 DAD檢測(cè)器(美國安捷倫公司);DF-15臺(tái)式連續(xù)投料粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司);AR-224CN電子天平、EX225DZH電子天平(奧豪斯儀器有限公司);KQ-500DE型醫(yī)院數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);MILLI-Q Direct16一體化超純水機(jī)(美國Millipore公司)。
1.2 試藥 水仙苷(中國食品藥品檢定研究院,批號(hào):111997-201501);色譜乙腈(默克化工技術(shù)有限公司);色譜甲酸(上海麥克林生化科技有限公司);色譜甲醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);實(shí)驗(yàn)用水皆為實(shí)驗(yàn)室自制二次蒸餾水;金線蓮藥材30批(經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院黃澤豪副教授鑒別,均為金線蓮),詳細(xì)信息見表1。
表1 金線蓮樣品信息
2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱:Uitimate?HPLC AQ-C18(4.6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈-0.1%甲酸(20∶80);流速:1.0mL/min;檢測(cè)波長:360 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量10μL。各峰與鄰峰的分離度均大于1.5,理論塔板數(shù)按水仙苷計(jì)算應(yīng)不低于6000??瞻兹軇?duì)照品及樣品的色譜圖見圖1。
2.2 對(duì)照品溶液的制備 取水仙苷對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1mL中含水仙苷0.1 mg溶液,搖勻,置4℃冰箱中備用。
2.3 供試品溶液的制備 精密稱取本品粉末(過4號(hào)篩)0.5g,精密加入80%甲醇25mL,稱定重量,超聲提取20 min(功率為350W,頻率50 Hz),放冷,稱重,用80%甲醇補(bǔ)足減失重量,搖勻,靜置,濾過,即得。
圖1 空白溶劑、對(duì)照品及樣品色譜圖
2.4 線性關(guān)系 取對(duì)照品儲(chǔ)備液,逐級(jí)稀釋為7.494、10.71、15.29、21.85、31.21、44.59μg/mL的對(duì)照品溶液,進(jìn)樣10μL,測(cè)定峰面積。以水仙苷的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X),以水仙苷色譜峰峰面積積分值(mAU)為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得水仙苷線性回歸方程:Y=9.1401X-20.554,相關(guān)系數(shù)r=0.9995,表明水仙苷在7.494~44.59μg/mL濃度范圍內(nèi)其濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。
2.5 加樣回收率 精密稱取金線蓮樣品(20171202-2)0.5g,分別按對(duì)照品:藥材含量(1∶0.5,1∶1,1∶1.5)的比例加入一定量的對(duì)照品,平行制備3份,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定各成分的峰面積,計(jì)算水仙苷的回收率及其RSD。結(jié)果,加樣回收率為97.62%~103.90%,RSD<3.0%,表明該方法回收率良好。
2.6 精密度實(shí)驗(yàn)
2.6.1 精密度 精密稱取同一批金線蓮樣品(批號(hào)20171202-2)1份,1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定日內(nèi)精密度,連續(xù)測(cè)定3 d,每天進(jìn)樣3針測(cè)定日間精密度。日內(nèi)精密度RSD為0.7597%,日間精密度RSD為0.8703%,表明儀器精密度良好。
2.6.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)為20171202-2的金線蓮樣品,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別于0、2、4、6、8、12、24 h按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定水仙苷的峰面積,計(jì)算含量均值與RSD,RSD均小于3%,結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批金線蓮樣品(批號(hào)20171202-2)6份,按“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定水仙苷的峰面積,RSD為0.688%,結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。
2.7 耐用性考察
2.7.1 改變分析儀器 取同一批金線蓮樣品(批號(hào)20171202-2),按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜方法,以不同品牌的色譜儀:Agilent 1260(檢測(cè)器:1260DADVL)和Waters e2695(檢測(cè)器:Waters 2998)2種高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定,RSD分別為0.7597%、0.6782%,表明本方法精密度良好,本色譜條件在一定色譜儀變動(dòng)情況下耐用。
2.7.2 改變色譜柱 取同一批金線蓮樣品(批號(hào)20171202-2),按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下以不同品牌的色譜柱:月旭XB-C18、Agilent SB-C18、Waters HSS T3進(jìn)樣測(cè)定,RSD分別為0.193%、0.461%、0.868%,表明本色譜條件在一定色譜柱變動(dòng)情況下耐用。
2.7.3 改變流動(dòng)相pH 取同一批金線蓮樣品(批號(hào)20171202-2),按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。在不同流動(dòng)相甲酸體積分?jǐn)?shù)(純水、0.10%、0.2%)下,按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定水仙苷的含量,RSD分別為1.856%、0.193%、0.875%,表明本色譜條件在一定流動(dòng)相pH值變動(dòng)情況下耐用。
2.7.4 改變色譜流速 取同一批金線蓮樣品(批號(hào)20171202-2),按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件以不同流速(0.25、0.30、0.35mL/min)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果水仙苷含量平均值為1.780mg/mL,RSD為0.15%,表明本色譜條件在一定流速變動(dòng)情況下耐用。
2.7.5 改變柱溫 取同一批金線蓮樣品(批號(hào)20171202-2),按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件以不同柱溫(25、30、35℃)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果水仙苷含量平均值為1.777mg/mL,RSD為0.39%,表明本色譜條件在一定柱溫變動(dòng)情況下耐用。
2.8 含量測(cè)定 按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,依法測(cè)定各批次金線蓮樣品,計(jì)算金線蓮藥材中水仙苷的含量,結(jié)果見表2。
本實(shí)驗(yàn)先后考察了不同提取溶劑(60%、70%、80%、90%、100%甲醇和60%、70%、80%、90%、100%乙醇)、不同提取時(shí)間(15、20、30 min)、不同提取溫度(常溫、30℃、40℃、50℃)、不同提取溶劑用量(20、25、30、35、40、45mL),發(fā)現(xiàn)80%甲醇25mL超聲提取20 min水仙苷提取率最高。
表2 各批次金線蓮測(cè)定結(jié)果(n=3)
本文建立一種簡便、實(shí)用的HPLC法分析金線蓮藥材水仙苷的含量。該方法專屬性和耐用性強(qiáng),簡便可靠,可以為金線蓮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升研究提供參考依據(jù)。