張嘉嘉，陳 濤，鮑 文，許 文，徐 偉，林 羽，張 勛

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122）

金線蓮為蘭科開(kāi)唇蘭屬植物花葉開(kāi)唇蘭［Anoectochilus roburghii（Wal1.）Lindl］的干燥 全草，主要分布在我國(guó)的福建、浙江、廣西、云南等地區(qū)，主要用于治療高血壓、糖尿病、心臟病、肺炎、急慢性肝炎、腎炎等疾?。?-2］。金線蓮主要成分為黃酮、金線蓮苷、多糖、核苷，其中黃酮類(lèi)被認(rèn)為是金線蓮的重要有效成分，具有抗癌、保肝、抗菌、降血糖、抗氧化等多種功效［3-5］?！陡＝ㄊ≈兴幉臉?biāo)準(zhǔn)2006年版》［6］《福建省中藥飲片炮制規(guī)范2012年版》［7］和《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范2005年版》［8］收載藥用金線蓮藥材及飲片，檢查項(xiàng)目包括水分、灰分、顯微鑒別和薄層鑒別，無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)。已有文獻(xiàn)報(bào)道金線蓮中含有蘆丁、水仙苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素和異槲皮苷等6種黃酮［9］，其中水仙苷的含量最高，因此，本文以水仙苷為指標(biāo)，建立高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定福建金線蓮水仙苷的含量，考察方法耐用性和可靠性，以期為金線蓮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供科學(xué)依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器 Agilent 1290高效液相色譜儀、G4212A 1290 DAD檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）；DF-15臺(tái)式連續(xù)投料粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；AR-224CN電子天平、EX225DZH電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；KQ-500DE型醫(yī)院數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；MILLI-Q Direct16一體化超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥 水仙苷（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111997-201501）；色譜乙腈（默克化工技術(shù)有限公司）；色譜甲酸（上海麥克林生化科技有限公司）；色譜甲醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水皆為實(shí)驗(yàn)室自制二次蒸餾水；金線蓮藥材30批（經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院黃澤豪副教授鑒別，均為金線蓮），詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 金線蓮樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱：Uitimate?HPLC AQ-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸（20∶80）；流速：1.0mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量10μL。各峰與鄰峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按水仙苷計(jì)算應(yīng)不低于6000。空白溶劑、對(duì)照品及樣品的色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取水仙苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1mL中含水仙苷0.1 mg溶液，搖勻，置4℃冰箱中備用。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取本品粉末（過(guò)4號(hào)篩）0.5g，精密加入80%甲醇25mL，稱(chēng)定重量，超聲提取20 min（功率為350W，頻率50 Hz），放冷，稱(chēng)重，用80%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，靜置，濾過(guò)，即得。

圖1 空白溶劑、對(duì)照品及樣品色譜圖

2.4 線性關(guān)系 取對(duì)照品儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋為7.494、10.71、15.29、21.85、31.21、44.59μg／mL的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積。以水仙苷的濃度（μg／mL）為橫坐標(biāo)（X），以水仙苷色譜峰峰面積積分值（mAU）為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得水仙苷線性回歸方程：Y＝9.1401X－20.554，相關(guān)系數(shù)r＝0.9995，表明水仙苷在7.494～44.59μg／mL濃度范圍內(nèi)其濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 加樣回收率 精密稱(chēng)取金線蓮樣品（20171202-2）0.5g，分別按對(duì)照品：藥材含量（1∶0.5，1∶1，1∶1.5）的比例加入一定量的對(duì)照品，平行制備3份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定各成分的峰面積，計(jì)算水仙苷的回收率及其RSD。結(jié)果，加樣回收率為97.62%～103.90%，RSD＜3.0%，表明該方法回收率良好。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

2.6.1 精密度 精密稱(chēng)取同一批金線蓮樣品（批號(hào)20171202-2）1份，1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定日內(nèi)精密度，連續(xù)測(cè)定3 d，每天進(jìn)樣3針測(cè)定日間精密度。日內(nèi)精密度RSD為0.7597%，日間精密度RSD為0.8703%，表明儀器精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)為20171202-2的金線蓮樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定水仙苷的峰面積，計(jì)算含量均值與RSD，RSD均小于3%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批金線蓮樣品（批號(hào)20171202-2）6份，按“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定水仙苷的峰面積，RSD為0.688%，結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

2.7 耐用性考察

2.7.1 改變分析儀器 取同一批金線蓮樣品（批號(hào)20171202-2），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜方法，以不同品牌的色譜儀：Agilent 1260（檢測(cè)器：1260DADVL）和Waters e2695（檢測(cè)器：Waters 2998）2種高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，RSD分別為0.7597%、0.6782%，表明本方法精密度良好，本色譜條件在一定色譜儀變動(dòng)情況下耐用。

2.7.2 改變色譜柱 取同一批金線蓮樣品（批號(hào)20171202-2），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下以不同品牌的色譜柱：月旭XB-C18、Agilent SB-C18、Waters HSS T3進(jìn)樣測(cè)定，RSD分別為0.193%、0.461%、0.868%，表明本色譜條件在一定色譜柱變動(dòng)情況下耐用。

2.7.3 改變流動(dòng)相pH 取同一批金線蓮樣品（批號(hào)20171202-2），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。在不同流動(dòng)相甲酸體積分?jǐn)?shù)（純水、0.10%、0.2%）下，按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定水仙苷的含量，RSD分別為1.856%、0.193%、0.875%，表明本色譜條件在一定流動(dòng)相pH值變動(dòng)情況下耐用。

2.7.4 改變色譜流速 取同一批金線蓮樣品（批號(hào)20171202-2），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件以不同流速（0.25、0.30、0.35mL／min）進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果水仙苷含量平均值為1.780mg／mL，RSD為0.15%，表明本色譜條件在一定流速變動(dòng)情況下耐用。

2.7.5 改變柱溫 取同一批金線蓮樣品（批號(hào)20171202-2），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件以不同柱溫（25、30、35℃）進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果水仙苷含量平均值為1.777mg／mL，RSD為0.39%，表明本色譜條件在一定柱溫變動(dòng)情況下耐用。

2.8 含量測(cè)定 按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定各批次金線蓮樣品，計(jì)算金線蓮藥材中水仙苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)先后考察了不同提取溶劑（60%、70%、80%、90%、100%甲醇和60%、70%、80%、90%、100%乙醇）、不同提取時(shí)間（15、20、30 min）、不同提取溫度（常溫、30℃、40℃、50℃）、不同提取溶劑用量（20、25、30、35、40、45mL），發(fā)現(xiàn)80%甲醇25mL超聲提取20 min水仙苷提取率最高。

表2 各批次金線蓮測(cè)定結(jié)果（n＝3）

本文建立一種簡(jiǎn)便、實(shí)用的HPLC法分析金線蓮藥材水仙苷的含量。該方法專(zhuān)屬性和耐用性強(qiáng)，簡(jiǎn)便可靠，可以為金線蓮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升研究提供參考依據(jù)。