陳錦明，王維斌，張 萍，黃 娜，鄧 姣，俞 潔*

（1.福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，福建 福州350122；2.麗水市第二人民醫(yī)院，浙江 麗水323000）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是女性常見的內分泌紊亂性疾病之一，與女性不孕不育有密切聯(lián)系。據(jù)報道，臨床約有50%～70%的PCOS患者存在胰島素抵抗（insulin resistance，IR）現(xiàn)象［1］。研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢組織中存在能夠介導胰島素作用的所有信號蛋白和代謝酶，且PCOS患者卵巢組織中出現(xiàn)IR現(xiàn)象，當前研究認為其分子機制主要與胰島素信號傳導通路環(huán)節(jié)異常相關［2］。在西醫(yī)藥物治療方面，主要應用二甲雙胍等胰島素增敏藥物。研究發(fā)現(xiàn)，應用化痰法能夠有效改善PCOS合并IR患者的臨床癥狀，提高臨床治療的總有效率，且安全性較應用二甲雙胍高［3］。而針對化痰法改善PCOS卵巢組織IR現(xiàn)象的作用途徑卻少有報道。因此，為進一步探討化痰法改善卵巢組織IR的生物學機制，本實驗研究了化痰法對PCOS模型大鼠卵巢組織胰島素受體（insulin receptor，INSR）底物IRS-1和IRS-2 mRNA及蛋白表達水平的影響，為PCOS的臨床治療提供部分參考依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 21日齡SPF級SD雌性大鼠40只，體質量（50±10）g，均購于上海斯萊克動物有限責任公司，許可證號：SYXK（閩）2014-0001，動物合格證編號：2015000540932。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級屏障系統(tǒng)，許可證編號：SYXK（閩）2014-0001，飼養(yǎng)環(huán)境溫度及濕度恒定，溫度（20±2）℃，濕度40%～60%，12 h周期性光照環(huán)境。本實驗已通過福建中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查。

1.2 實驗藥物 二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：H20023370）。二陳湯藥物組成：陳皮15g，姜半夏15g，茯苓9g，炙甘草4.5g，委托福建省第三人民醫(yī)院制備，4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗試劑 脫氫表雄酮（DHEA，上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10098326）；逆轉錄和SYBR試劑盒（日本TAKARA公司，批號AI21033A、AI12394A）；注射用大豆油劑（江西益普生藥業(yè)有限公司，批號：20160602）；羊抗兔二抗（英國MDL公司，批號：MD2141）；兔抗胰島素受體底物（IRS）-1一抗，兔抗IRS-2一抗，兔抗β-actin一抗（英國Abcam公司，批號分別為ab53167、ab134101、ab8227）；蘇木素-伊紅染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：20180727）。

1.4 實驗儀器 QuantStudio6 Flex型實時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；ChemiDoxTMXRS＋型化學發(fā)光凝膠成像儀、170-3940型半干轉印槽、170-3930型垂直電泳系統(tǒng)、170-4070型轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；SHP-250型生化箱（上海精宏實驗設備有限公司）；Infinite M200 Pro多功能酶標儀（奧地利Tecan公司）；Nandrop2000型超微量紫外分光光度計（美國Thermo Scientific公司）。

2 實驗方法

2.1 動物造模與分組 采用DHEA誘導PCOS模型大鼠［4］。將40只21日齡SPF級SD雌性大鼠，適應性喂養(yǎng)2 d后，按體質量由大到小的順序依次編號，采用隨機數(shù)字表法分為正常組12只和造模組28只。造模組大鼠每日于頸背部皮下注射DHEA［6mg／（100 g·d）＋0.2mL注射用大豆油］，正常組每日頸背部皮下注射0.2mL的注射用大豆油，連續(xù)注射20 d。造模結束后，將成模大鼠按體質量從大到小依次編號，采用隨機數(shù)字表法分為模型組、二陳湯組、二甲雙胍組各8只。二陳湯組按4.35 g／（kg·d）予二陳湯灌胃，二甲雙胍組按0.158mg／（kg·d）予二甲雙胍灌胃，模型組及正常組給予等體積滅菌飲用水灌胃，分別干預4周后取材。實驗期間均采用普通飼料喂養(yǎng)。

2.2 ELISA法檢測大鼠血清指標 根據(jù)ELISA試劑盒說明書進行操作，在450 nm波長下測定各樣本OD值，繪制標準曲線后計算出血清雄激素（T）和胰島素（INS）水平濃度。

2.3 Real-time PCR檢測大鼠卵巢組織IRS-1和IRS-2 mRNA表達 將卵巢組織勻漿后，用TRI zol法提取總RNA，逆轉錄為cDNA后進行PCR反應。引物序列由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成，IRS-1（143 bp）：上游5"-CYGCACTCACCCTAG ACCCA-3"，下游5"-TGACTCCGAAATTCACGCCG-3"；β-actin（136 bp）：上游5"-CTCTGTGTGGATTGGTG GCT-3"，下游5"-AGCTCAGTAACAGTCCGCC T-3"；IRS-2（197 bp）：上 游5"-GCATGTTTCCAACCAAC GCT-3"，下游5"-GAGTGTACTCCATCAGCCCT-3"。反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火31 s，40個循環(huán)。以β-actin為內參，采用相對定量分析法進行分析。

2.4 Western blot檢測大鼠卵巢組織IRS-1和IRS-2蛋白表達 從大鼠卵巢組織中提取總蛋白，運用BCA蛋白定量法測定所提取的蛋白濃度，根據(jù)不同蛋白分子量分離相應膠帶，并將蛋白轉移至PVDF膜上。抗體稀釋比例：IRS-1、IRS-2一抗（1∶1500），β-actin一抗（1∶5000）；IRS-1、IRS-2、β-actin二抗（1∶2000）。ECL發(fā)光檢測，以β-actin為內參，應用Image Lab軟件進行灰度分析。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料，采用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；若方差齊性，采用LSD方法分析；若方差不齊，選擇Dunnett T3方法進行兩兩比較。

3 結果

3.1 4組大鼠血清T、INS濃度比較 見表1。

表1 4組大鼠血清T、INS濃度比較（±s）

表1 4組大鼠血清T、INS濃度比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

INS／（mU／L）0.41±0.050.49±0.050.42±0.140.38±0.06組別正常組模型組二甲雙胍組二陳湯組n 8888 T／（nmol／L）0.37±0.112.96±1.231）0.43±0.162）0.42±0.152）

3.2 4組大鼠卵巢組織IRS-1、IRS-2 mRNA水平比較 見表2。

表2 4組大鼠卵巢組織IRS-1、IRS-2 mRNA水平比較（±s）

表2 4組大鼠卵巢組織IRS-1、IRS-2 mRNA水平比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01，3）P＜0.05。

IRS-21.06±0.460.20±0.051）0.75±0.072）0.81±0.192）組別正常組模型組二甲雙胍組二陳湯組n 8888 IRS-11.07±0.340.63±0.151）1.02±0.242）0.91±0.283）

3.3 4組大鼠卵巢組織IRS-1和IRS-2蛋白表達比較 見表3、圖1。

圖1 4組大鼠卵巢組織IRS-1、IRS-2蛋白電泳圖

表3 4組大鼠卵巢組織IRS-1、IRS-2蛋白表達比較（±s）

表3 4組大鼠卵巢組織IRS-1、IRS-2蛋白表達比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01。

IRS-20.51±0.050.27±0.021）0.41±0.022）0.50±0.022）組別正常組模型組二甲雙胍組二陳湯組n 8888 IRS-10.58±0.060.28±0.061）0.41±0.070.57±0.072）

4 討論

IR是PCOS重要的病理生理基礎，IRS-1和IRS-2作為胰島素受體后信號傳導的主要船塢蛋白，與胰島素信號轉導關系最為密切［5］。研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者的卵泡膜細胞中IRS-1及IRS-2表達水平明顯升高［6］，而PCOS-IR僅表現(xiàn)出胰島素代謝功能異常，其甾體激素分泌功能未受影響，IRS-1及IRS-2的表達水平升高會促使卵泡膜細胞分泌過量的雄激素，導致卵巢局部高雄激素血癥的發(fā)生［7-8］。因此，臨床中常應用胰島素增敏劑，促使PCOS患者的胰島素敏感性增強，改善胰島素抵抗，同時有效降低雄激素水平［9］，從而降低卵泡發(fā)育異常及排卵障礙。本研究結果顯示，模型組大鼠血清T水平明顯升高，血清INS水平也出現(xiàn)升高趨勢，卵巢組織中IRS-1、IRS-2的mRNA和蛋白表達水平均顯著下降，說明模型組大鼠出現(xiàn)高雄激素血癥且卵巢組織中出現(xiàn)胰島素信號通路環(huán)節(jié)異常，這將提高卵巢組織局部的高雄激素血癥及胰島素抵抗發(fā)生的可能，從而導致卵泡的發(fā)育與排卵受到影響。

在PCOS中醫(yī)證型分布中，痰濕證的占據(jù)比例高［10］。張紅陽等［11］通過研究不同穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）的PCOS患者中醫(yī)體質分布規(guī)律，發(fā)現(xiàn)不同HOMA-IR組中痰濕質所占比均較高，提示“痰濕”與IR之間存在一定關系。郝松莉等［12］進一步對比分析痰濕型與非痰濕型PCOS患者的臨床生化特征，發(fā)現(xiàn)痰濕型PCOS患者較非痰濕型存在更為明顯的糖脂代謝以及胰島素異常。本研究以化痰法經典代表方劑二陳湯作為干預手段，探討化痰法對PCOS大鼠卵巢組織胰島素受體底物表達的影響。結果顯示，與模型組比較，二陳湯組IRS-1、IRS-2 mRNA及蛋白水平均明顯升高，提示二陳湯可能通過改善卵巢組織中蛋白受損狀態(tài)，調節(jié)卵泡的胰島素受體信號傳導通路，提高對胰島素的敏感性，使胰島素與受體結合的能力恢復；同時血清T水平明顯降低，提示二陳湯可改善卵巢局部激素環(huán)境，其作用機制是否同胰島素增敏劑調控卵巢組織糖代謝的同時影響卵巢的內分泌功能，還有待進一步的研究證實。

綜上所述，二陳湯化痰法可以降低PCOS模型大鼠血清T水平，使卵巢局部微環(huán)境得到改善，促進卵巢組織中胰島素受體底物IRS-1、IRS-2 mRNA及蛋白水平的表達上調，從而提高卵巢組織對胰島素的敏感性，加強對胰島素的利用，進而改善卵泡IR狀態(tài)。