任 杰，李 黎（通訊作者），鐘雪梅，鄭愛芳，李菲菲，馬 濤

（新疆喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 新疆 喀什 844000）

1.資料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)條件

DMEM+10% FBS，37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)

1.2 主要試劑

雙熒光素酶報(bào)告基因；PCR反應(yīng)試劑盒，轉(zhuǎn)染試劑盒，定點(diǎn)突變試劑盒，限制性內(nèi)切酶DNA NotI, XhoI, Taq DNA聚合酶。

1.3 Q-PCR引物設(shè)計(jì)

用目標(biāo)基因SNP rs1051052-C設(shè)計(jì)引物，以所需擴(kuò)增基因片段DNA為模板建立PCR反應(yīng)體系，純化PCR產(chǎn)物；完善質(zhì)粒擴(kuò)增與抽提，酶切，連接和轉(zhuǎn)化，將質(zhì)粒及引物結(jié)果與基因庫內(nèi)3'UTR區(qū)域序列進(jìn)行比對驗(yàn)證，見表1。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

1.4.1 載體構(gòu)建 根據(jù)PCR擴(kuò)增片段比對結(jié)果，將含有SNP rs1051052-G片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、NotⅠ進(jìn)行定點(diǎn)位切后與質(zhì)粒構(gòu)建載體HmiT104523-MT06，同時在CE Design Ⅴ1.03網(wǎng)站上設(shè)計(jì)SNP rs1051052-G定點(diǎn)突變引物，利用定點(diǎn)突變試劑盒進(jìn)行G→C定點(diǎn)突變，并構(gòu)建載體CS-HmiT104523-MT05-01。通過雙酶切與載體相應(yīng)區(qū)域連接構(gòu)建靶克隆對照載體CmiT000001-MT05，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列

1.4.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 分別將構(gòu)建好的熒光素酶報(bào)告基因載體與雙熒光素酶基因結(jié)合，以高質(zhì)量的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，將含有轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)液與轉(zhuǎn)染液輕柔混勻，用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染48 h后，用化學(xué)發(fā)光儀測定熒光素發(fā)光度以顯示靶標(biāo)活性。

1.4.3 miRNA干擾 利用snpinfo軟件預(yù)測SNP rs1051052-G位點(diǎn)潛在結(jié)合的miRNA,合成miRNA以及它的抑制劑，并用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，定量檢測實(shí)驗(yàn)組及對照組不同分組細(xì)胞熒光數(shù)值，鑒定miRNA作用靶點(diǎn)。

1.4.4 miRNA靶標(biāo)活性檢測 分別檢測miRNA及miRNA mimics與報(bào)告基因載體的雙熒光素酶活性數(shù)值，反應(yīng)對靶標(biāo)的調(diào)控活性，見表2。

表2 Gluc和SEAP表達(dá)量及抑制率

2.結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)將miRNA mimics, miRNA mimics陰性對照，靶標(biāo)克隆對照，3'UTR靶標(biāo)克隆（野生型），3'UTR靶標(biāo)克?。ㄍ蛔冃停┓謩e組合，將實(shí)驗(yàn)分為六組（A組-F組），以海腎熒光素酶（GLuc）基因作為報(bào)告基因，分泌型堿性磷酸酶（SEAP）基因?yàn)閮?nèi)參基因，使用熒光素酶檢測法檢測活性，通過熒光素酶基因與Alpha-1-AT內(nèi)參照基因拷貝數(shù)比值進(jìn)行相應(yīng)計(jì)算，不同組間報(bào)告基因活性的比較采用t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示miRNA mimics對野生型靶標(biāo)的抑制效率約為38.94%（1～27.07%/44.33%），對突變型靶標(biāo)的抑制率41.93%（1～28.41%/48.92%），抑制效率并無明顯差異（P＞0.05），提示SNP rs1051052-G位點(diǎn)靶標(biāo)位點(diǎn)的突變不顯著影響miRNA對靶標(biāo)的抑制作用。

進(jìn)一步將3'UTR靶標(biāo)克隆野生型、3'UTR靶標(biāo)克隆突變型與對照組分為三組（G組-Ⅰ組）進(jìn)行檢測及對比，結(jié)果顯示miRNA mimics對靶標(biāo)克隆野生型及靶標(biāo)克隆突變型的抑制效率為分別為52.65%（1～47.35%）、53.01%（1～44.99%）（P＜0.05），結(jié)果顯示可能存在其他內(nèi)源性物質(zhì)對野生型靶標(biāo)及突變型靶標(biāo)存在明顯的抑制作用。

3.討論

慢性阻塞性肺病是基因多態(tài)性和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果[1]，以不完全可逆性氣流受限為表現(xiàn)，將成為全球第五位因病死亡原因，社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，目前，破譯COPD易感位點(diǎn)的功能機(jī)制，為臨床提供治療靶點(diǎn)，是目前的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

在眾多基因中，蛋白質(zhì)編碼基因占總基因的比例＜2%[2]，很大一部分被轉(zhuǎn)錄成非編碼基因，α1-AT基因位于14q32.1，編碼絲氨酸蛋白酶抑制劑，是較為確定的與COPD相關(guān)的易感基因[3]，但α1-AT基因3'UTR區(qū)域如何調(diào)控和影響COPD的發(fā)生發(fā)展，尚不明確[4]；為進(jìn)一步明確SNP rs1051052-G位點(diǎn)與miRNA之間的功能關(guān)系及如何影響COPD的發(fā)生發(fā)展，本研究結(jié)合相關(guān)生物信息學(xué)分析以及功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探究。

3’UTR區(qū)域?yàn)榉蔷幋a區(qū)，是真核生物基因的重要結(jié)構(gòu)成分，主要功能涉及基因的表達(dá)調(diào)控，miRNAs是通過相應(yīng)靶基因與mRNA中3’UTR不完全配對結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因表達(dá)[5]從而影響mRNA的穩(wěn)定性，導(dǎo)致mRNA的抑制或降解，最終影響基因表達(dá)。

不同暴露條件下的COPD患者miRNA存在不均一表達(dá)性，有對照研究結(jié)果顯示，不同組織暴露于煙霧24周后，肺組織中有31個miRNA表達(dá)下調(diào)，灌洗液中有78個miRNA表達(dá)上調(diào)[6]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，吸煙可誘導(dǎo)循環(huán)miRNAs的差異表達(dá)，miR-149-3p等miRNA的下調(diào)可通過調(diào)節(jié)TLR-4/NF-κB信號通路增加IL-1β和TNF-α的分泌，增強(qiáng)COPD患者的炎癥反應(yīng)[7]。

研究發(fā)現(xiàn)維吾爾族人群攜帶rs1051052-G等位基因可能有較高的COPD患病風(fēng)險[8]，本研究進(jìn)一步利用雙熒光素酶基因檢測，通過miRNA和miRNA抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞證實(shí)比對，明確SNP rs1051052-G位點(diǎn)突變不特定影響相關(guān)miRNA對靶標(biāo)的抑制作用，但本實(shí)驗(yàn)的目的靶標(biāo)存在一定的抑制表現(xiàn)，可能細(xì)胞本身存在內(nèi)源性miRNA或內(nèi)源性物質(zhì)對野生型及突變型靶標(biāo)存在明顯的抑制作用，但尚不能確認(rèn)是哪種或哪幾種miRNA起到調(diào)控作用，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究探討。

綜上所述，本研究初步解析了非編碼區(qū)SNP rs1051052-G調(diào)控基因表達(dá)的分子機(jī)制，完成了靶標(biāo)位點(diǎn)的功能驗(yàn)證，有助于為進(jìn)一步了解遺傳因素對維吾爾族COPD發(fā)病的影響，尋找一些潛在的miRNA生物標(biāo)志物信息，為提供個體差異的診斷及治療提供參考。