劉鵬，車子凡，張徐祥

(污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學環(huán)境學院，江蘇 南京 210023)

近年來，全球范圍內(nèi)介水傳染病的暴發(fā)已嚴重危害到各國人民生命健康，據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，每年因介水傳染病而死亡的人數(shù)超過200萬人，其中58%的死亡病例與安全飲用水的缺乏、惡劣的環(huán)境衛(wèi)生和個人衛(wèi)生狀況有關(guān)[1]。介水傳染病的病原體主要包括細菌、病毒、原生動物和寄生蟲等，其中病毒具有更強的傳染性，對常規(guī)水處理工藝的耐受性更強，對人體健康的威脅更大。因此，加強對水環(huán)境中病毒的監(jiān)測，對于控制病毒的環(huán)境傳播，降低疾病暴發(fā)風險，保障人體健康，具有重要意義。

長期以來，我國對水環(huán)境中病原微生物的監(jiān)測一直依賴于糞便指示菌的檢測。但是，以糞大腸菌群、大腸埃希氏桿菌等為代表的糞便指示菌很難準確反映水環(huán)境中病原微生物尤其是病毒的污染水平[2-4]。為保證水環(huán)境的生物安全，必須建立高效、穩(wěn)定和經(jīng)濟的病毒檢測方法，從而實現(xiàn)對病毒的直接檢測。近年來，針對水環(huán)境中病毒的檢測已有大量文獻報道，不同研究之間采用的檢測方法存在較大差異?，F(xiàn)重點總結(jié)了水環(huán)境中病毒富集方法和分子生物學檢測方法，以期為水環(huán)境中病毒檢測與控制提供方法學支撐。

1 病毒富集方法

與臨床樣品相比，水環(huán)境中病毒含量較低，因此，對其檢測必須依賴高效的前處理方法，通過富集濃縮提高待測樣品中病毒的濃度，從而提高病毒的檢測能力。相比于細菌，水環(huán)境中病毒的尺寸更小，其平均尺寸一般不超過100 nm。因此，水環(huán)境中細菌富集常用的微孔濾膜過濾法，對病毒的富集效果不佳。目前，常用于水環(huán)境中病毒的富集方法主要包括過濾法、吸附法、離心法和混凝法等。

1.1 過濾法

過濾法的原理是利用孔徑小于病毒顆粒尺寸的濾膜對病毒顆粒進行截留，類似于使用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜富集水體中的細菌。Wang等[5]利用孔徑分別為0.45，0.2和0.1 μm的微孔濾膜對污水處理廠污水進行分級過濾，僅保留0.1 μm 的微孔濾膜用于病毒分析。該方法原理清晰，所需實驗器材較少，但由于微孔濾膜過水面積和孔徑均較小，極易出現(xiàn)濾膜堵塞現(xiàn)象。此外，該方法僅獲得尺寸介于0.1～0.2 μm的病毒顆粒，對于尺寸>0.2 μm(如埃博拉病毒[6]、煙草花葉病毒[7]等)或尺寸<0.1 μm(如輪狀病毒[8]、甲肝病毒[9]和寨卡病毒[10]等)的病毒顆粒無法有效富集。

切向流過濾技術(shù)能有效克服垂直過濾法過水面積小、濾膜易堵塞的缺點，用于處理較大體積的水環(huán)境樣品[11]。使用0.2 μm和99.97 ku孔徑的兩級濾膜，分別實現(xiàn)水樣中細菌等大尺寸顆粒物的去除和病毒顆粒的富集，濾膜過水面積達1 m2，一次性可處理100 L水樣。目前，該方法已用于海水[12]和回用水[13]等樣品的處理，能較好地富集病毒顆粒。但切向流過濾系統(tǒng)較為復雜，使用成本高，樣品處理耗時較長，單個樣品處理時間需10 h以上，且過濾處理后的水樣體積仍超過50 mL，需依賴密度梯度離心等濃縮方法進行后續(xù)處理[11]。

1.2 吸附法

吸附法是利用水中病毒顆粒攜帶一定的電荷，能吸附于荷電濾膜表面的特點，對水樣中病毒顆粒進行富集的方法。吸附于濾膜表面的病毒顆?？赏ㄟ^較小體積緩沖液洗脫，從而達到富集的目的。根據(jù)濾膜表面攜帶電荷的差異，濾膜主要包括正電荷濾膜和負電荷濾膜。

病毒顆粒的等電點一般介于3.5～7[14]，因此，在弱酸、中性或者堿性水樣中，病毒顆粒攜帶負電，能直接吸附于正電荷濾膜表面。常用的正電荷濾膜包括NanoCeram濾膜和1MDS濾膜。1MDS濾膜最早用于水樣中病毒顆粒的富集，在河水和飲用水中均得到廣泛應用[15]，對飲用水中?？刹《?型的平均回收率為33%[16]，而對河水和飲用水中脊髓灰質(zhì)炎病毒的加標回收率分別為36%和67%[17]。1MDS濾膜使用方便，不需要對水樣進行預處理，處理水樣體積大(超過1 000 L)，且不易堵塞。但是，該濾膜價格高昂，單個濾膜價格超過200美元，日常監(jiān)測使用成本過高。

NanoCeram濾膜是一種材質(zhì)為氧化鋁纖維的正電荷濾膜，價格低于1MDS濾膜，并且能取得不亞于1MDS濾膜的病毒回收效果。通過向污水處理廠出水中添加脊髓灰質(zhì)炎病毒，分別使用1MDS濾膜和NanoCeram濾膜對病毒進行富集，2種濾膜對病毒的截留效率分別超過97%和89%，而NanoCeram濾膜的洗脫效率和洗脫液二次濃縮回收率要高于1MDS濾膜，1MDS濾膜和NanoCeram濾膜的整體回收率為23%和57%[18]。Karim等[17]比較了2種濾膜對飲用水和河水中脊髓灰質(zhì)炎病毒和諾瓦克病毒的回收效率，同樣發(fā)現(xiàn)NanoCeram濾膜對病毒的回收率不低于1MDS濾膜。NanoCeram濾膜對不同病毒的回收率也存在一定差異。Pang等[19]發(fā)現(xiàn)對柯薩奇病毒、埃可病毒、諾如病毒、輪狀病毒和腺病毒41型的回收率分別為41%～67%，22%～90%，23%～44%，24%～46%和24%～35%。Gibbons等[20]對40 L海水中病毒進行富集，發(fā)現(xiàn)NanoCeram濾膜對諾如病毒和腺病毒的截留效率均高于98%，但是對腺病毒的洗脫效率較差，導致腺病毒的回收率不超過3%，遠遠低于諾如病毒96%的回收率。

正電荷濾膜可直接用于吸附病毒顆粒，而負電荷濾膜用于吸附病毒顆粒時需對水樣進行一定的處理。一般情況下，病毒顆粒攜帶負電荷，可以通過向水中添加一定濃度的Mg2+或Al3+等多價陽離子，通過陽離子架橋作用使病毒顆粒吸附于負電荷濾膜表面[21]。當病毒顆粒吸附于濾膜表面后，使用一定濃度的稀硫酸淋洗濾膜去除陽離子，同時將pH值降低至病毒顆粒等電點以下，此時病毒顆粒攜帶正電荷，從而直接吸附于濾膜表面。最后，通過較小體積的NaOH溶液洗脫病毒顆粒完成富集過程?；蛘咧苯訉⑺畼觩H值調(diào)節(jié)至3.5左右，低于病毒顆粒等電點，使得病毒顆粒攜帶正電荷，從而直接吸附于濾膜表面[22]，再直接使用NaOH溶液洗脫病毒顆粒。通過使用添加Mg2+的方法處理水樣，負電荷濾膜對病毒加標后的250～500 mL超純水、自來水、瓶裝水、河水以及池塘水中的諾如病毒回收率分別為186%，80%，167%，15%和39%，高于對脊髓灰質(zhì)炎病毒的回收率[21]。與正電荷濾膜相比，負電荷濾膜對大部分病毒的回收率更高，使用更為便捷，價格更為便宜，而其最大的劣勢在于很難處理大體積水樣，其處理能力一般不超過10 L[15]。近年來，Hata等[23]設(shè)計了一種筒式混合纖維酯材質(zhì)的負電荷濾膜，其處理體積可達1 000 L，對河水和自來水中病毒的回收率為10%～54%。

除濾膜外，一些特殊材質(zhì)的填料也可被用于病毒的吸附，比如硅膠[24]、硅藻土[25]、玻璃纖維[26]和活性炭[27]等。Lambertini等[26]使用玻璃纖維對飲用水中病毒進行富集，對脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、?？刹《?8型、腺病毒41型和諾如病毒的回收分別為70%，14%，19%，21%和29%。

1.3 離心法

使用過濾法和吸附法對病毒進行富集，可得到體積在10～500 mL的病毒濃縮液，但需進一步濃縮。對于體積較小的樣品，可以直接使用超高速離心法進行處理[27-30]。Kapoor等[28]與Victoria等[29]分別使用35 000 g離心3 h和22 000 g離心2 h進行病毒有效分離。超高速離心法富集適用于體積較小的樣品，且依賴于超高速冷凍離心機。

1.4 混凝法

混凝法是通過添加混凝劑，使水中的膠體粒子與病毒顆粒結(jié)合，再通過離心沉降富集病毒顆粒的方法。常見的混凝劑可分為有機混凝劑和無機混凝劑，有機混凝劑如PEG8000[31]、脫脂奶粉[32]、牛肉膏[33-34]等，無機混凝劑如氯化鐵[35-36]、氯化鋁[37]。通過添加混凝劑，可以在較低離心轉(zhuǎn)速下實現(xiàn)病毒顆粒的沉降和分離，擺脫對超高速冷凍離心機的依賴。

2 基于聚合酶鏈式反應的病毒檢測方法

環(huán)境病毒學肇始于20世紀對污水和飲用水中脊髓灰質(zhì)炎病毒的檢測，其研究目的是為評估脊髓灰質(zhì)炎病毒的環(huán)境行為以及公共安全風險[38]。由于病毒本身沒有繁殖能力，嚴格依賴宿主細胞，因此早期病毒檢測多依賴傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)法，實驗中需通過觀測細胞病變來判斷。然而，由于多數(shù)病毒難以培養(yǎng)，如肝炎病毒和諾瓦克病毒等，部分病毒培養(yǎng)過程中宿主細胞很難出現(xiàn)明顯的病變反應，且病毒侵染細胞的過程較長，難以實現(xiàn)病毒快速、敏感和便捷的檢測。分子生物學技術(shù)，尤其是聚合酶鏈式反應(PCR)技術(shù)的發(fā)展，為實現(xiàn)病毒快速、靈敏和特異的檢測提供了可能。

針對不同的病毒設(shè)計特異性引物和探針序列，采用普通PCR或逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)可直接對病毒進行定性檢測。Verheyen等[39]利用PCR和RT-PCR技術(shù)對287處水源水中腺病毒和輪狀病毒進行了檢測，發(fā)現(xiàn)2種病毒的陽性率分別為12.9%和2.9%。除了普通PCR和RT-PCR，病毒檢測還包括巢式PCR(Nested PCR)、多重PCR(Multiplex PCR)、實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)、細胞聯(lián)合培養(yǎng)PCR(Integrated cell culture PCR，ICC-PCR)和數(shù)字PCR(Digital PCR，dPCR)等。

2.1 巢式PCR

為提高檢測的靈敏度和特異性，在普通PCR的基礎(chǔ)上開發(fā)出了巢式PCR技術(shù)。通過2輪PCR反應，使用2套引物擴增特異性DNA片斷，其中第2對引物能特異性地擴增位于首輪PCR產(chǎn)物中的一段DNA片斷。Lam等[40]通過巢式PCR檢測了包括甲型流感病毒在內(nèi)的21種呼吸道病毒，結(jié)果表明其靈敏度是普通PCR的100～1 000倍。

2.2 多重PCR

針對普通PCR僅能檢測單個病毒的缺點，多重PCR技術(shù)通過在單個PCR反應中設(shè)計多個引物，能同時實現(xiàn)對多種病毒的檢測[41]。Hao等[42]開發(fā)出2套引物體系，實現(xiàn)了犬類4種呼吸道病毒和4種腸道病毒的同時檢測。然而，不同引物退火溫度的差異導致多重PCR很難達到最佳反應條件。某些情況下，仍需依賴寡核苷酸雜交技術(shù)對實驗結(jié)果的特異性進行驗證[43]。

2.3 實時熒光定量PCR

普通PCR只能實現(xiàn)對病毒的定性檢測，而qPCR通過收集PCR擴增反應中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號對起始模板進行定量分析。根據(jù)使用熒光物質(zhì)的不同，可以分為染料法和探針法2類[44]。與染料法相比，探針法需額外使用探針序列對目的基因片段進行擴增，特異性更強，目前在環(huán)境病毒檢測中的應用最為廣泛[36]。

2.4 細胞聯(lián)合培養(yǎng)PCR

將細胞培養(yǎng)和PCR相結(jié)合，用于環(huán)境中具有實際感染能力病毒的檢測。原理是通過PCR方法快速檢測病毒感染宿主后在細胞內(nèi)復制時產(chǎn)生的病毒核酸來檢測具有感染性的病毒，比單純的細胞培養(yǎng)法和PCR方法更靈敏。Ryu等[45]利用綠猴腎細胞系(buffalo green monkey kidney，BGMK)對柯薩奇病毒A10型、?？刹《?0型、脊髓灰質(zhì)炎病毒和腸病毒70型進行培養(yǎng)至出現(xiàn)細胞病變，再提取病毒核酸利用PCR技術(shù)進行檢測。與細胞培養(yǎng)法相比，ICC-PCR能夠大大縮短檢測時間，但仍存在無法精確定量的問題。

2.5 數(shù)字PCR

近年來，dPCR在病原微生物的檢測中得到越來越多的應用。dPCR是一種基于單分子PCR進行計數(shù)的核酸定量方法，采用當前分析化學熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴中，每個反應器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個。經(jīng)過PCR循環(huán)后，有1個核酸分子模板的反應器會給出熒光信號，而沒有模板的反應器則無熒光信號。根據(jù)熒光信號的相對比例和反應器體積推算原始溶液的核酸濃度[50]。與qPCR技術(shù)相比，該方法對目的基因片段的定量不依賴于標準曲線，并且具有更低的檢測限和靈敏度。在生菜和飲用水甲型肝炎病毒和諾如病毒的檢測中，dPCR對病毒的靈敏度不低于qPCR，并且在PCR抑制劑存在的情況下仍可獲得穩(wěn)定的定量結(jié)果[51]。

采用基于PCR的方法檢測實際環(huán)境樣品病毒含量時，除dPCR外，其余幾種方法檢測靈敏度極易受PCR抑制劑的影響[46]。病毒檢測前的富集過程致使大量PCR抑制劑同時被富集。PCR抑制劑可能造成樣品裂解，目標核酸片段降解，并干擾目的基因擴增[47]。例如，在進行大體積水樣病毒檢測時，天然有機物的存在會降低PCR擴增效率，導致95%加標水樣中鼠諾如病毒的回收率不足10%[48]。因此，需要在實驗過程中添加特定的病毒株設(shè)置實驗對照，從而對實驗的各個流程進行質(zhì)量控制，包括病毒富集、核酸提取和PCR過程[49]。根據(jù)內(nèi)標病毒株添加階段不同，實驗對照包括全流程對照(樣品富集前加入內(nèi)標)、分子過程對照(核酸提取前加入內(nèi)標)和PCR對照(PCR前加入內(nèi)標)[49]。

3 基于高通量測序技術(shù)的病毒檢測方法

PCR檢測法局限于對單個或數(shù)個病毒的檢測，難以實現(xiàn)對整個病毒群落組成或病毒遺傳多樣性的全面檢測。近年來，迅猛發(fā)展的高通量測序技術(shù)和宏基因組技術(shù)，逐步取代以克隆文庫為代表的研究病毒遺傳多樣性的傳統(tǒng)方法[52]，為環(huán)境中病毒的高通量檢測和新型病毒的挖掘打開了一扇嶄新的大門[49,53]。

與細菌不同，病毒中不存在類似于16S rRNA基因片段的分子進化標志，無法使用特定的引物擴增保守區(qū)域來研究病毒遺傳多樣性，必須對病毒全部基因片段進行測序[54]。病毒宏基因組學，也被稱為宏病毒組學，是通過提取環(huán)境樣品中病毒的核酸(DNA或RNA)，結(jié)合高通量測序技術(shù)對全部核酸片段進行測序的技術(shù)，主要包括病毒顆粒分離、核酸提取(DNA或RNA)、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA、核酸片段化和測序等流程[55]。在完成高通量測序后，如何從海量數(shù)據(jù)中識別病毒序列成為制約宏病毒組學技術(shù)發(fā)展和應用的關(guān)鍵問題。近年來，通過對高通量測序的生物信息學分析，研究者們開發(fā)出了一系列免費的生物信息學軟件。但各軟件在病毒序列識別的原理、準確性和對計算機性能的依賴存在較大的差異。目前常用的宏病毒組學中病毒序列識別生物信息學軟件見表1。

表1 宏病毒組學中病毒序列識別生物信息學軟件

宏病毒組學技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)療診斷、傳染病暴發(fā)和環(huán)境病毒的檢測中得到了廣泛的應用。臨床診斷是目前宏病毒組應用最為廣泛的領(lǐng)域。病毒的臨床診斷通常依賴于嚴格的培養(yǎng)和診斷測試，而宏病毒組學技術(shù)可用于罕見病毒或新型病毒的快速鑒別。如2009年甲型流感(H1N1)暴發(fā)期間，高通量測序技術(shù)在新型流感病毒的鑒別和分型中發(fā)揮了重大作用[61]。在2019年底出現(xiàn)的新型冠狀病毒肺炎疫情中，中國科學家于2020年1月11日即在NCBI數(shù)據(jù)庫公布新型冠狀病毒基因組序列，為后期疫情防控提供了重要依據(jù)[62]。

復雜環(huán)境中病毒的多樣性由于研究手段的限制一直被嚴重低估，基于高通量測序技術(shù)的宏病毒組學技術(shù)在病毒檢測中的應用，揭示了不同環(huán)境病毒豐富的多樣性。近年來，宏病毒組學技術(shù)被廣泛應用于水環(huán)境、土壤環(huán)境[63-66]、大氣環(huán)境[67]中病毒的檢測。其中，包括市政污水[68-69]、養(yǎng)殖廢水[70]、醫(yī)療廢水[71]、娛樂水體[72]、海水[73]在內(nèi)的水環(huán)境中均發(fā)現(xiàn)了多種已知和未知的病毒。

4 結(jié)語

準確檢測水環(huán)境中病毒，是水環(huán)境生物安全保障的關(guān)鍵。目前，在病毒樣品制備的實際操作中，常采用多種富集方法相結(jié)合的策略，極大提高了富集效率。同時，PCR及其衍生技術(shù)和高通量測序技術(shù)則為水環(huán)境中病毒快速、準確和全面檢測提供了基礎(chǔ)。但是，目前水環(huán)境病毒檢測方法仍存在一些問題，主要包括：(1)缺乏統(tǒng)一標準的病毒富集方法。不同研究者之間采用的富集方法各異，病毒的回收率存在較大差異，導致不同研究之間缺乏可比性；(2)由于病毒存在較高的基因突變，而基于PCR技術(shù)的病毒檢測方法依賴于準確高效的引物和探針序列設(shè)計，導致參考已有研究的引物及探針序列可能會低估環(huán)境中病毒的豐度；(3)目前采用基于宏病毒組學技術(shù)檢測水環(huán)境病毒時，不同分析軟件結(jié)果之間存在較大差異，缺少統(tǒng)一的分析流程。針對以上問題，亟須建立水環(huán)境中病毒富集的標準方法，這也有賴于相關(guān)部門出臺指導手冊或相關(guān)標準。此外，針對病毒的分子生物學檢測方法，則應進一步完善并實時更新已知病毒的核酸序列信息，構(gòu)建更為全面、準確的病毒數(shù)據(jù)庫，從而為水環(huán)境病毒檢測技術(shù)標準化提供支撐。