魏光鈺，胡 勇，吳永琴，張清壯，李 鑫

（1. 貴陽(yáng)市煙草公司清鎮(zhèn)市分公司，貴州 清鎮(zhèn) 551400；2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

烤煙產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展與植煙土壤質(zhì)量以及土壤微生態(tài)環(huán)境息息相關(guān)。土壤微生物主要參與植物養(yǎng)分的循環(huán)利用、土壤結(jié)構(gòu)的維持以及農(nóng)用化學(xué)品的降解等過(guò)程[1]。有研究表明，土壤中微生物的組成與功能決定了植物的生存狀況[2]以及發(fā)病率[3]。健康的微生態(tài)系統(tǒng)對(duì)作物生長(zhǎng)至關(guān)重要。土壤微生物組成單一以及病原菌富集是土壤連作障礙的主要成因[4-5]?？緹熯B續(xù)種植以及化肥的大量施用，往往導(dǎo)致植煙土壤質(zhì)量劣變[6]、有害微生物數(shù)量增加[7]、烤煙產(chǎn)量下降[8]等問(wèn)題。因此，研究安全有效的土壤消毒技術(shù)是保障烤煙產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的有利舉措。

土壤強(qiáng)還原處理（RSD）是通過(guò)向土壤中添加易降解的有機(jī)物，灌水、覆膜，在短時(shí)間內(nèi)形成厭氧、強(qiáng)還原以及高溫的環(huán)境，產(chǎn)生揮發(fā)性氣體、有機(jī)酸等各類(lèi)物質(zhì)，有效殺滅病原菌，重新組建微生物群落的方法[9]。王寶英等[10]通過(guò)向土壤中添加有機(jī)物料，淹水覆膜處理后能明顯著增加芥藍(lán)產(chǎn)量，降低根腫病的發(fā)病率。伍朝榮等[11]發(fā)現(xiàn)通過(guò)土壤強(qiáng)還原處理可顯著改變番茄連作土壤中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)組成及多樣性，有效降低土壤中青枯菌數(shù)量。Strauss等[12]將當(dāng)?shù)剞r(nóng)作物秸稈作為有機(jī)物料添加到土壤中，當(dāng)添加量達(dá)到20.2 t/hm2即可形成病原菌致死致命環(huán)境。而Wen等[13]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)秸稈添加量為3、1.5 t/hm2時(shí)均能有效抑制尖刀鐮刀菌生長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，在RSD處理過(guò)程中，有機(jī)物料的添加量以及處理后微生物群落的變化與處理效果息息相關(guān)。已有RSD法用于芥藍(lán)[10]、三七[14]等不宜連作作物的研究報(bào)道，然而大部分研究聚焦在有機(jī)物料種類(lèi)選擇和用量確定2個(gè)方面，并且試驗(yàn)往往以大棚或盆栽的形式開(kāi)展，而關(guān)于RSD處理在實(shí)際種植生產(chǎn)中應(yīng)用的研究報(bào)道較少。

筆者聚焦引起煙草土傳病害相關(guān)的的真菌群落結(jié)構(gòu)，利用RSD技術(shù)，探索有機(jī)物料不同添加量對(duì)菌群多樣性、結(jié)構(gòu)及烤煙產(chǎn)量的影響，以期為RSD技術(shù)的推廣利用、健康煙田土壤微環(huán)境的重組以及煙葉優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)田位于貴州省清鎮(zhèn)市紅楓湖鎮(zhèn)駱家橋村烤煙種植基地，該地區(qū)屬于北亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)氣候，年平均氣溫14.1℃，年降雨量1 180.9 mm，無(wú)霜期283 d。該試驗(yàn)田已連續(xù)5 a種植烤煙。試驗(yàn)前0～20 cm土層的基本理化性質(zhì)為：有機(jī)質(zhì)36.23 g/kg，全氮2.00 g/kg，堿解氮135.31 mg/kg，有效磷32.50 mg/kg，速效鉀428.74 mg/kg，pH值6.62。供試有機(jī)物料為甘蔗渣，總有機(jī)碳（TOC）含量為45.6%，全氮（TN）含量為1.12%，C/N=40.7。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)處理，分別為：CK，不做任何土壤處理的對(duì)照；T1，甘蔗渣添加量為9 t/hm2的RSD處理；T2，甘蔗渣添加量為13.5 t/hm2的RSD處理。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，共9個(gè)小區(qū)，每小區(qū)面積為36 m2。各小區(qū)之間以40 cm深、30 cm寬的溝渠隔開(kāi)。RSD處理的具體步驟如下：煙田平整后，將甘蔗渣均勻撒在土壤表面，通過(guò)旋耕機(jī)將其與耕作層土壤混合均勻并充分灌溉，用塑料膜覆蓋處理30 d，處理期間土壤溫度為20～30℃。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 土壤樣品采集 待RSD處理結(jié)束后，揭開(kāi)塑料薄膜，采集土壤樣品。各小區(qū)按“S”型五點(diǎn)取樣法，每個(gè)小區(qū)取≥1.5 kg的土樣，過(guò)2 mm篩。過(guò)篩后的土壤樣品分成2份：一份自然風(fēng)干后用于土壤主要理化性質(zhì)測(cè)定，另一份保存在-80℃，用于土壤真菌多樣性測(cè)定。

1.3.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定 測(cè)定指標(biāo)包括pH值、有機(jī)質(zhì)（SOM）、全氮（TN）、堿解氮（AN）、有效磷（AP）、速效鉀（AK），具體方法參見(jiàn)鮑士旦[15]編著的《土壤農(nóng)化分析》。

1.3.3 群落結(jié)構(gòu)檢測(cè) 采用高通量測(cè)序法檢測(cè)土壤真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)：用DNA試劑盒（FastDNA?Spin Kit）提取土壤樣本中的DNA，用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)所提取的DNA進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)；經(jīng)PCR擴(kuò)增純化后，將純化后的擴(kuò)增子根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU（Operational taxonomic unit）聚類(lèi)，生成OTU表格[16]。具體試驗(yàn)過(guò)程由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.3.4 烤煙產(chǎn)量統(tǒng)計(jì) 煙葉烘烤后，分別統(tǒng)計(jì)各處理的上等煙比例、均價(jià)、產(chǎn)量、產(chǎn)值，并折算成單位面積煙葉產(chǎn)量、產(chǎn)值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用R語(yǔ)言計(jì)算相關(guān)性，采用Origin 9.1及TBtools[17]作圖，并采用SPSS 25軟件中單因素方差分析（oneway ANOVA）和Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 RSD處理對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

由表1可知，與CK處理相比，施用甘蔗渣的RSD處理可明顯提高土壤pH值，但是不同施用量對(duì)土壤pH值的提升效果不一致，其中T2處理土壤pH提升最大，由6.617提升至7.128，較CK處理增加了7.72%。與對(duì)照相比，RSD處理后的土壤有機(jī)質(zhì)（SOM）、全氮（TN）、堿解氮（AN）的含量顯著增加，并且土壤中有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、有效磷、速效鉀的含量隨甘蔗渣施用量的增加而增加，其中T1處理土壤中有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、有效磷、速效鉀的含量較CK處理分別增加了24.48%、11.96%、7.66%、32.01%、24.14%；T2處理土壤中有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、有效磷、速效鉀的含量較CK處理分別增加了36.18%、19.77%、21.93%、80.28%、58.63%。

表1 各處理的土壤理化性質(zhì)

2.2 RSD處理對(duì)土壤真菌多樣性的影響

3個(gè)處理共9個(gè)土壤樣品經(jīng)高通量測(cè)序后得到508 476個(gè)序列，在相似度97%的水平下聚類(lèi)后共得到1 053個(gè)OTU。所有處理的真菌稀疏曲線都趨向于接近飽和平滑（圖1B），說(shuō)明測(cè)序reads的數(shù)據(jù)量是足夠的。各處理間OTU的重疊情況用Venn圖顯示，由圖1A可知，3個(gè)處理間共有的OTU數(shù)量為110個(gè)，而特有的OTU數(shù)目以T2處理最多。

圖1 RSD處理對(duì)土壤真菌多樣性的影響

經(jīng)過(guò)30 d的RSD處理后，土壤中真菌群落的豐富度指數(shù)（Chao1、ACE）和多樣性指數(shù)（Simpson、Shannon）如表2所示。與CK處理相比，T1、T2處理的Simpson指數(shù)有所降低，而Chao1、ACE豐富度指數(shù)明顯升高，且各處理間差異顯著。這表明RSD處理可改變土壤真菌群落的豐富度和多樣性，且隨著甘蔗渣施用量的增加，土壤真菌群落豐富度和多樣性隨之提高。當(dāng)甘蔗渣施用量為13.5 t/hm2時(shí)，土壤中真菌群落多樣性變化最大。

表2 RSD處理對(duì)土壤真菌多樣性指數(shù)的影響

2.3 RSD處理對(duì)土壤真菌群落組成的影響

采用Principal coordinate analysis（PCA）從物種分類(lèi)中門(mén)的角度分析了不同處理土壤中的真菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖2所示。PCA分析第一軸解釋度為45.61%，第二軸解釋度為32%；在門(mén)水平上，3組處理土壤樣品中真菌群落具有顯著差異；其中，CK處理與T1、T2處理間的距離較遠(yuǎn)，表明CK處理與RSD處理之間的微生物群落結(jié)構(gòu)相似度很低；而T1和T2之間距離也較遠(yuǎn)，表明RSD處理時(shí)甘蔗渣施用量對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)也有明顯的影響。

圖2 不同處理間土壤真菌群落在門(mén)水平的主坐標(biāo)分析

由圖3A可知，各處理土壤中真菌主要由子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、壺菌門(mén)（Chytridiomycota）、被孢霉門(mén)（Mortierellomycota）、油壺菌門(mén)（Olpidiomycota）、毛霉菌門(mén)（Mucoromycota）、羅茲菌門(mén)（Rozellomycota）等17個(gè)真菌門(mén)組成。其中，子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、油壺菌門(mén)和壺菌門(mén)是對(duì)照土壤中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)；經(jīng)RSD處理后，土壤中子囊菌門(mén)的豐度顯著增加，擔(dān)子菌門(mén)、油壺菌門(mén)和羅茲菌門(mén)的相對(duì)豐度則明顯降低。由圖3B可知，土壤中真菌屬主要由木霉屬（Trichoderma）、毀絲霉屬（Myceliophthora）、擬青霉屬（Simplicillium）、黑孢殼屬（Melanospora）、帚霉屬（Scopulariopsis）等19個(gè)真菌屬組成，其中優(yōu)勢(shì)菌屬是木霉屬、毀絲霉屬、擬青霉屬、黑孢殼屬。與CK處理相比，油壺菌屬（Olpidium）的相對(duì)豐度在T1、T2處理中顯著降低，而木霉屬的相對(duì)豐度在T1、T2處理中顯著增加，毀絲霉屬的相對(duì)豐度則在T2處理中顯著增加。

2.4 RSD處理后土壤中變化顯著的真菌屬

由圖4可知，經(jīng)RSD處理后，土壤中炭黑粉菌（Anthracoidea）的相對(duì)豐度顯著減少，由CK處理的2.21%減少到T2處理的0.17%；油壺菌屬（Olpidium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、鏈格孢屬（Alternaria）的相對(duì)豐度經(jīng)過(guò)土壤強(qiáng)還原處理后顯著降低，其中油壺菌屬?gòu)膶?duì)照處理的10.97%下降到T2處理的0.48%，減少了95.62%；鐮刀菌屬和鏈格孢屬則未在T2處理中發(fā)現(xiàn)。與CK相比，RSD處理能顯著增加土壤中端梗孢屬（Acrophialophora）和毀絲霉屬（Myceliophthora）的相對(duì)豐度，并且隨著甘蔗渣施用量的增加，土壤中這2種真菌屬的相對(duì)豐度增加。與CK相比，木霉屬的相對(duì)豐度顯著增加，由CK的0.16%增加到T1的20.13%、T2的18.63%，分別增加了124.8、115.4倍。這說(shuō)明RSD處理能顯著改變土壤中部分真菌屬的相對(duì)豐度。

圖3 RSD處理土壤真菌門(mén)（A）、屬（B）水平的相對(duì)豐度

圖4 RSD處理后土壤中變化顯著真菌屬的相對(duì)豐度

2.5 土壤理化性質(zhì)與真菌群落的關(guān)聯(lián)分析

對(duì)土壤理化性質(zhì)指標(biāo)和真菌屬相對(duì)豐度利用R計(jì)算進(jìn)行spearman相關(guān)性分析，結(jié)果通過(guò)FDR（false discovery rate）校正，采用TBtools軟件獲得相關(guān)性熱圖。由圖5可知，土壤中炭黑粉菌屬（Anthracoidea）、鐮刀菌屬（Fusarium）、鏈格孢屬（Alternaria）、油壺菌屬（Olpidium）與部分土壤理化性質(zhì)指標(biāo)呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)性，其中炭黑粉菌屬與土壤有機(jī)質(zhì)、有效磷極顯著負(fù)相關(guān)，與速效鉀顯著負(fù)相關(guān)；鐮孢屬與土壤有效磷、速效鉀顯著負(fù)相關(guān)；鏈格孢屬則與土壤速效鉀極顯著負(fù)相關(guān)，與全氮、堿解氮、有效磷顯著負(fù)相關(guān)；油壺菌屬僅與土壤有機(jī)質(zhì)顯著負(fù)相關(guān)。此外，毀絲霉屬（Myceliophthora）與土壤有效磷、速效鉀極顯著正相關(guān)，與全氮顯著正相關(guān)；柄孢殼屬（Zopfiella）與土壤pH值、有效磷顯著正相關(guān)。

2.6 RSD處理對(duì)烤煙經(jīng)濟(jì)性狀的影響

經(jīng)RSD處理后，煙葉的經(jīng)濟(jì)性狀如表3所示，與CK相比，RSD處理能顯著增加烤煙的產(chǎn)量和產(chǎn)值，提升上等煙比例；上等煙比例表現(xiàn)為T(mén)2＞T1＞CK。對(duì)比T1、T2處理可知，甘蔗渣的添加量會(huì)影響烤煙的經(jīng)濟(jì)性狀，隨著甘蔗渣施用量的增加，烤煙產(chǎn)值和上等煙比例增加。T2處理的產(chǎn)量較CK提高了8.18%，較T1提高了2.97%；T2處理的烤煙產(chǎn)值較CK提高了13.90%，較T1提高了5.42%。由此可知，RSD處理可提高烤煙的產(chǎn)量和產(chǎn)值，且效果隨著甘蔗渣施用量的增加而增強(qiáng)。

表3 不同處理烤煙的經(jīng)濟(jì)性狀

圖5 土壤真菌屬與理化性質(zhì)的相關(guān)性熱圖

3 結(jié)論與討論

通過(guò)將甘蔗渣與土壤混合，灌水、覆膜處理30 d后，土壤pH值由CK處理的6.617提升至T2處理的7.128，且對(duì)pH值的提升效果隨著甘蔗渣的添加量增加而增強(qiáng)，這一現(xiàn)象與Zhao等[18]的研究結(jié)果基本一致。土壤有機(jī)質(zhì)含量與甘蔗渣的施用量直接相關(guān)，這可能是由于甘蔗渣未完全分解，產(chǎn)生的小分子有機(jī)物成為土壤有機(jī)質(zhì)的一部分，從而提高了土壤有機(jī)質(zhì)含量[19]。RSD處理還可以顯著提高土壤中全氮、堿解氮、有效磷、速效鉀的含量。這些養(yǎng)分含量的升高對(duì)于改善土壤理化性質(zhì)、提高煙草產(chǎn)量以及改善煙葉品質(zhì)有一定促進(jìn)作用[20]。

添加有機(jī)質(zhì)對(duì)土壤進(jìn)行厭氧處理可明顯改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[21-22]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，RSD處理后，土壤中真菌Simpson多樣性指數(shù)減小，Chao1、ACE豐富度指數(shù)顯著增加，表明經(jīng)過(guò)RSD處理，土壤真菌群落的豐富度以及多樣性增加，Huang等[16]的也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。經(jīng)RSD處理后，土壤中子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著增加，擔(dān)子菌門(mén)、油壺菌門(mén)和羅茲菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著降低。這可能是因?yàn)樵趨捬?、?qiáng)還原性、高溫環(huán)境中，甘蔗渣分解產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體、有機(jī)酸、低價(jià)重金屬等各類(lèi)有毒物質(zhì)，在殺滅病原微生物的同時(shí)改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[23]。T2處理土壤中毀絲霉屬相對(duì)豐度顯著增加，這是因?yàn)镽SD處理使土壤環(huán)境溫度升高，而毀絲霉屬在高溫環(huán)境中表現(xiàn)出獨(dú)特的生存適應(yīng)能力，能夠通過(guò)分泌多種酶（纖維素酶、漆酶、木聚糖酶、果膠酶、脂肪酶、植酸酶和其他雜酶）降解有機(jī)物中幾乎所有種類(lèi)多糖而大量繁殖[24]。作為一種從土壤分離的最常見(jiàn)有益真菌，木霉屬真菌能產(chǎn)生許多具有生物活性的物質(zhì)（包括細(xì)胞壁降解酶和次生代謝產(chǎn)物），用以抑制多種植物病原菌的生長(zhǎng)[25]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，RSD處理可以顯著增加木霉屬真菌的相對(duì)豐度，這對(duì)于維護(hù)健康微生態(tài)環(huán)境具有重要意義。此外，土壤中引起煙草赤霉病的鐮刀菌屬、引起赤星病的鏈格孢屬以及作為病毒介體的油壺菌屬的相對(duì)豐度均顯著降低，表明RSD技術(shù)能有效殺滅土壤中病原菌。這是由于在RSD處理過(guò)程中，有機(jī)物厭氧分解產(chǎn)生對(duì)病原菌有毒有害的物質(zhì)，如乙酸、丙酸、氨、硫化氫、低價(jià)金屬離子等。以上結(jié)果表明，有益微生物增加和RSD處理造成的環(huán)境因素改變均能降低病原菌的豐度[26]。

此外，Liu[27]的研究表明，環(huán)境因素是重組細(xì)菌群落的決定因素。土壤中添加甘蔗渣后，理化性質(zhì)以及真菌群落結(jié)構(gòu)顯著異于對(duì)照處理，并且油壺菌屬、鐮刀菌屬、鏈格孢屬與部分理化性質(zhì)指標(biāo)顯著負(fù)相關(guān)，毀絲霉屬與部分理化性質(zhì)指標(biāo)顯著正相關(guān)。這說(shuō)明在連作植煙土壤中添加甘蔗渣，能夠重新組建真菌群落，降低病原菌豐度，增加拮抗菌豐度，保證煙草健康生產(chǎn)[28-29]。此外，對(duì)各處理烤煙的產(chǎn)量、產(chǎn)值和上等煙比例進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，RSD處理能提升烤煙的產(chǎn)量、產(chǎn)值及上等煙比例，并且T2處理烤煙的產(chǎn)量、產(chǎn)值及上等煙比例均高于其他2個(gè)處理。這說(shuō)明RSD處理后有助于改善煙葉質(zhì)量，同時(shí)提升烤煙的經(jīng)濟(jì)效益，且效果隨著甘蔗渣施用量的增加而增強(qiáng)。

綜上所述，對(duì)連作植煙土壤進(jìn)行RSD處理，不同的有機(jī)物施用量對(duì)植煙土壤理化性質(zhì)以及真菌群落結(jié)構(gòu)的影響隨著有機(jī)物施用量的增加而增強(qiáng)，高有機(jī)物施用量對(duì)土壤中病原菌的滅菌效果更好。這主要是因?yàn)槭┯昧吭蕉鄬?duì)環(huán)境因素的影響越大，導(dǎo)致土壤真菌群落改變，促進(jìn)烤煙產(chǎn)質(zhì)量的提升。但是，有機(jī)物料施用量對(duì)微生物群落以及烤煙生長(zhǎng)是否存在閾值，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。