徐玉萍 王繼業(yè) 田 群

(1 桂林醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生所，廣西桂林市 541004，電子郵箱：1121886678@qq.com；2 桂林市第二人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣西桂林市 541001；3 桂林市第三人民醫(yī)院感染病科，廣西桂林市 541001)

HIV感染分為急性期、無癥狀期和AIDS期，當(dāng)患者進(jìn)入AIDS期時(shí)，病情發(fā)展迅速，生命健康受到嚴(yán)重威脅[1]。鑒于AIDS的危害性，世界各國(guó)的衛(wèi)生系統(tǒng)制定了相關(guān)政策、措施來預(yù)防和治療AIDS，雖然目前已經(jīng)取得矚目的成績(jī)，但由于無法根治且容易在易感人群中傳播，AIDS仍未得到有效的控制，AIDS防治仍是全球公共衛(wèi)生面臨的重要挑戰(zhàn)之一[2-3]。當(dāng)前缺乏特效治療藥物是AIDS死亡率高的根本原因，研究顯示，抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法是一種有效抑制病毒復(fù)制的治療方法，可大大提高患者的生存質(zhì)量[4]，但該療法僅僅作用于主動(dòng)復(fù)制的病毒，并不能根除潛伏的病毒。隨著近年來對(duì)HIV的研究不斷深入，越來越多證據(jù)表明人體內(nèi)微小RNA(microRNA，miRNA)與HIV復(fù)制密切相關(guān)[5-6]。目前國(guó)內(nèi)未見關(guān)于HIV感染患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中 miRNA-191、miRNA-21的表達(dá)與HIV載量相關(guān)性的研究。本研究旨在分析HIV感染或AIDS患者(HIV/AIDS患者)PBMC中 miRNA-191、miRNA-21的表達(dá)水平與HIV載量的關(guān)系，初步探討miRNA-191和miRNA-21作為AIDS患者診療靶點(diǎn)的可能性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月至2019年1月在桂林市第三人民醫(yī)院治療的63例HIV感染者和25例AIDS患者作為研究對(duì)象，選取同時(shí)期在該院進(jìn)行健康體檢的50例健康者作為對(duì)照組，其中HIV感染者和AIDS患者的診斷符合《艾滋病診療指南第三版(2015版)》[7]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。3組研究對(duì)象的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18歲以上，具有完全民事行為能力；(2)HIV感染者和AIDS患者感染的HIV類型為HIV-1；(3)對(duì)本次研究?jī)?nèi)容知情并愿意配合研究，自愿簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等可能影響miRNA表達(dá)的疾病者；(2)孕婦、哺乳期、精神病或抑郁癥患者。3組研究對(duì)象的性別、年齡、文化程度、婚姻狀況、傳播途徑等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究符合道德倫理要求，已通過桂林市第三人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查。

表1 3組研究對(duì)象的一般資料的比較

1.2 PBMC的分離及培養(yǎng) 采集患者晨起空腹肘靜脈血5 mL，轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，加入5 mL磷酸緩沖鹽溶液(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，批號(hào)：s20190907)稀釋，輕輕混勻。取兩支15 mL離心管，先加入5 mL Ficoll溶液(上海創(chuàng)賽科技有限公司，批號(hào)：20190624)，然后將5 mL稀釋的血液輕輕加入離心管的Ficoll溶液上層，離心機(jī)2 000 r/min離心20 min。用吸管將白色細(xì)胞層細(xì)胞吸取至另一干凈的10 mL離心管中，加入磷酸緩沖鹽溶液至5～10 mL，1 500 r/min離心10 min后去掉上清。用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，將單個(gè)核細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(上海逍鵬生物科技有限公司，批號(hào)：LX190421)，接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，在37℃、5% CO2的條件下貼壁孵育6 h，收集貼壁細(xì)胞即為單核細(xì)胞，用吉姆薩染色，取細(xì)胞純度大于85%者用于提取總RNA。

1.3 健康正常人和HIV/AIDS患者之間表達(dá)差異miRNA的篩選 采用隨機(jī)數(shù)字表法選取上述研究對(duì)象中的3例健康人群、3例HIV感染者和3例AIDS患者作為基因芯片檢測(cè)對(duì)象，篩選差異表達(dá)miRNA。將提取的組織總RNA進(jìn)行靶標(biāo)制備，對(duì)miRNA芯片進(jìn)行了RNA標(biāo)記和雜交。使用mirVana miRNA分離試劑盒(美國(guó)Ambion公司，產(chǎn)品批號(hào)：KGS512)純化100μg總RNA，獲得miRNA。用Cy3(美國(guó)ChemeGen 公司，產(chǎn)品批號(hào)：1010386-62-5)標(biāo)記純化后的miRNA，在miRNA芯片(Agilent Technologies公司)上進(jìn)行雜交，與939個(gè)人類miRNA基因比對(duì)。應(yīng)用miRNA芯片分析系統(tǒng)(Agilent Feature Extraction v10.7, Agilent Gene Spring軟件)P-value法對(duì)基因芯片雜交結(jié)果進(jìn)行分析。按如下標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)miRNA，其中|log2變化倍數(shù)|≥6為上調(diào)基因；|log2變化倍數(shù)|≤-2為下調(diào)基因。miRNA表達(dá)譜基因芯片為由北京博奧生物有限公司提供的Agilent基因芯片。

1.4 血漿HIV病毒載量的檢測(cè) 收集88例HIV/AIDS患者血液樣本，3 000 r/min離心15 min，分離血漿保存于醫(yī)用-4℃冰箱中備用，取1 mL患者血漿置入S-tube管中，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(探針法)檢測(cè)血漿病毒載量，TaqMan全自動(dòng)病毒載量?jī)x購自Roche公司，檢測(cè)試劑盒為HIV-1 Testv2.0(廣州市鴻洲實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司，批號(hào)：1812045003)。以HIV/AIDS患者病毒載量水平的中位數(shù)為臨界值，分為病毒載量低水平組和病毒載量高水平組。

1.5 PBMC中 miRNA-191、miRNA-21的檢測(cè) 使用胰蛋白酶消化PBMC后，使用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，采用微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度，再使用一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海一研生物有限公司，批號(hào)：20181128)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA按1 ∶1 000比例稀釋后，使用U6作為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，PCR儀購自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司(型號(hào)：iCycler)，miRNA引物均由廣州市銳博生物科技有限公司合成。反應(yīng)體系總體積20 μL，其中SYBR Green 10 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 7 μL、上游引物1 μL和下游引物1 μL。反應(yīng)條件：94℃ 3 min；95℃ 45 s；62℃ 30 s；72℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán)。miRNA-191上游引物為5′-GCUGCGCUUGGAUUUCGUCCCC-3′，下游引物為5′-CAACGGAATCCCAAAAGC-3′；miRNA-21上游引物為5′-CCGCTCGAGGGTAGGAGG-3′，下游引物為5′-GCTAGACCTCTGGGCCTC-3′;U6上游引物為5′-GC-CAACGTCAGTAGGCAGA-3′，下游引物為5′-GCCAAC-CATGATCTGCTGAAAC-3′。采用2-ΔΔCt法分析miRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t法；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)[M(P25,P75)]表示，兩組間比較采用Mann-Whitneyu檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩兩比較采用Tamhane′s T2檢驗(yàn)。采用Pearson檢驗(yàn)分析雙變量的相關(guān)性；采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析miRNA-191與miRNA-21預(yù)測(cè)HIV急性感染期和AIDS期的價(jià)值。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 健康正常人和HIV/AIDS患者PBMC中差異表達(dá)的miRNA 基因芯片檢測(cè)結(jié)果顯示，健康正常人和HIV/AIDS患者間共有10組miRNA的表達(dá)水平存在差異，見圖1。其中，hsa-miRNA-191、hsa-miRNA-23a、hsa-miRNA-146a、hsa-miRNA-31、hsa-miRNA-29a、hsa-miRNA-34這6種基因在HIV/AIDS患者中表達(dá)下調(diào)，以hsa-miRNA-191下調(diào)程度最高；hsa-miRNA-21、hsa-miRNA-423、hsa-miRNA-15a、hsa-miRNA-205這4種基因在HIV/AIDS患者中表達(dá)上調(diào)，其中hsa-miRNA-21上調(diào)程度最高。故選取高度差異的 miRNA-191和miRNA-21作為研究的miRNA。

圖1 健康正常人和HIV/AIDS患者PBMC中miRNA的表達(dá)差異

2.2 HIV/AIDS患者與健康正常人PBMC中miRNA-191和miRNA-21表達(dá)水平的比較 與健康正常人比較，急性感染期、無癥狀期HIV感染者和AIDS患者PBMC中的miRNA-21相對(duì)表達(dá)水平升高，而miRNA-191相對(duì)表達(dá)水平降低(均P<0.05)；與無癥狀期HIV感染者比較，急性感染期HIV感染者和AIDS患者PBMC中的miRNA-21相對(duì)表達(dá)水平升高，而miRNA-191相對(duì)表達(dá)水平降低(均P<0.05)。見表2。

表2 HIV/AIDS患者與健康正常人PBMC中miRNA-191和miRNA-21相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

2.3 不同臨床特征HIV/AIDS患者的病毒載量及PBMC中miRNA-191、miRNA-21表達(dá)水平的比較 不同性別、年齡HIV/AIDS患者的病毒載量及PBMC中 的miRNA-191、miRNA-21相對(duì)表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與低水平病毒載量HIV/AIDS患者比較，高水平病毒載量HIV/AIDS患者的病毒載量和miRNA-21相對(duì)表達(dá)水平升高，miRNA-191相對(duì)表達(dá)水平降低(均P<0.05)；與無癥狀期HIV感染者比較，急性感染期HIV感染者和AIDS患者的病毒載量升高(均P<0.05)。見表3。

表3 不同臨床特征HIV/AIDS患者病毒載量及PBMC中miRNA-191、 miRNA-21相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

2.4 HIV/AIDS患者病毒載量與PBMC中miRNA-191、miRNA-21表達(dá)水平的相關(guān)性 HIV/AIDS患者的病毒載量與PBMC中的miRNA-191表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.482，P<0.001)，與miRNA-21表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.247，P=0.020)。

2.5 HIV/AIDS患者PBMC 中miRNA-191與miRNA-21表達(dá)水平預(yù)測(cè)HIV急性感染期和AIDS期的價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，以約登指數(shù)最大時(shí)為臨界點(diǎn)，miRNA-191和miRNA-21最佳臨界值分別為0.805和1.125，其對(duì)應(yīng)的曲線下面積分別為0.794(95%CI：0.700～0.888；P<0.001)和0.685(95%CI：0.569～0.800；P<0.001)，提示miRNA-191與miRNA-21對(duì)HIV急性感染期和艾滋病期具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。其中miRNA-191預(yù)測(cè)HIV急性感染期和AIDS期的靈敏度為65.2%，特異度為83.3%；miRNA-21預(yù)測(cè)HIV急性感染期和AIDS期的靈敏度為64.3%，特異度為76.1%。見圖2和圖3。

圖2 miRNA-191預(yù)測(cè)HIV急性感染期和AIDS期的ROC曲線

圖3 miRNA-21預(yù)測(cè)HIV急性感染期和AIDS期的ROC曲線

3 討 論

HIV-1是一種反轉(zhuǎn)錄病毒，人體感染HIV-1后可迅速結(jié)合細(xì)胞膜上的CD4分子，感染CD4+T淋巴細(xì)胞，使CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能障礙，最終導(dǎo)致AIDS的發(fā)生[8]。近年來學(xué)者對(duì)HIV的研究不斷深入，越來越多的研究證實(shí)miRNA在HIV感染中扮演重要角色。miRNA是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可特異性結(jié)合靶基因mRNA的非編碼區(qū)以促進(jìn)或抑制靶蛋白的翻譯，從而調(diào)控蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)，進(jìn)一步影響其生物學(xué)功能[9]。miRNA與機(jī)體各項(xiàng)生理功能和病理過程密切相關(guān)[10]。HIV進(jìn)入宿主細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，在復(fù)制過程中病毒基因與宿主基因發(fā)生復(fù)雜的作用。miRNA為廣泛分布在宿主體內(nèi)的基因，其可以通過直接作用于HIV轉(zhuǎn)錄本或病毒復(fù)制相關(guān)的周期蛋白來影響HIV復(fù)制。Modai等[11]的研究認(rèn)為miRNA可通過抑制Dicer1、HIV-1 Rev結(jié)合蛋白和HIV-EP2的表達(dá)來抑制病毒復(fù)制；王莉彥等[12]的研究認(rèn)為miRNA-29a可以直接作用于HIV轉(zhuǎn)錄本，抑制其轉(zhuǎn)錄及新病毒的產(chǎn)生。

本研究基因芯片檢測(cè)結(jié)果顯示，健康正常人與HIV/AIDS患者之間有10個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中HIV/AIDS患者的PBMC中有6種miRNA表達(dá)水平下調(diào)，僅有4種miRNA表達(dá)水平上調(diào)，提示miRNA表達(dá)差異對(duì)HIV有直接或間接的抑制或促進(jìn)效應(yīng)[13]。本研究中，HIV/AIDS患者的miRNA-191表達(dá)水平下調(diào)，而miRNA-21表達(dá)水平上調(diào)(均P<0.05)，后續(xù)定量分析結(jié)果與基因芯片檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)相同，故探討HIV與miRNA-191、miRNA-21的關(guān)系具有重要意義。miRNA-191是新近發(fā)現(xiàn)的一種長(zhǎng)度約為22nt的miRNA，在乳腺癌[14]、子宮內(nèi)膜癌[15]、骨肉瘤[16]等多種不同疾病中的表達(dá)存在差異，但目前關(guān)于miRNA-191與HIV相關(guān)性的研究不多。本研究結(jié)果顯示，HIV/AIDS患者的miRNA-191表達(dá)水平低于健康正常人，且急性感染期HIV感染者和AIDS患者的表達(dá)水平低于無癥狀期患者HIV感染者(均P<0.05)，提示miRNA-191可能是抑制HIV病情發(fā)展的保護(hù)因素。王莉彥等[12]的研究顯示，過表達(dá)hsa-miRNA-191-5p有可能通過借助靶標(biāo)核孔蛋白50和(或)C-C基序趨化因子受體1來實(shí)現(xiàn)抑制HIV復(fù)制的目的，與本研究結(jié)果相似。

研究顯示，血清中循環(huán)miRNA-21在HIV感染人群和HIV未感染人群中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[17]。本研究結(jié)果顯示，HIV/AIDS患者的miRNA-21表達(dá)水平高于健康正常人，而急性感染期HIV感染者和AIDS患者的miRNA-21表達(dá)水平高于無癥狀期HIV感染者(均P<0.05)，與上述研究結(jié)果相似，提示過表達(dá)miRNA-21可能是HIV感染發(fā)展的危險(xiǎn)因素。miRNA-21是單核細(xì)胞中γ-干擾素誘導(dǎo)蛋白10的重要調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)單核細(xì)胞分泌γ-干擾素誘導(dǎo)蛋白10來活化和促進(jìn)炎癥，而這些炎癥的活化與HIV感染進(jìn)展相關(guān)[18]。本文以HIV/AIDS患者病毒載量水平的中位數(shù)為臨界值，將HIV/AIDS患者分為病毒載量高水平組和低水平組，進(jìn)一步觀察兩組間miRNA-191和miRNA-21相對(duì)表達(dá)水平的差異。結(jié)果顯示，低水平和高水平病毒載量HIV/AIDS患者之間的miRNA-191和miRNA-21相對(duì)表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；雙變量相關(guān)分析結(jié)果顯示，miRNA-191表達(dá)水平與HIV病毒載量呈負(fù)相關(guān)，miRNA-21表達(dá)水平與HIV病毒載量呈正相關(guān)(均P<0.05)。這提示miRNA-191表達(dá)水平上調(diào)可以抑制HIV復(fù)制，而miRNA-21表達(dá)水平上調(diào)增加了HIV復(fù)制量。

眾所周知，急性感染期HIV感染者和AIDS患者體內(nèi)的HIV大量復(fù)制，因此這兩個(gè)臨床分期患者病毒載量較無癥狀期大大提升，本研究觀察到不同臨床分期患者中miRNA-191、miRNA-21的表達(dá)水平與病毒載量水平趨勢(shì)相似，且ROC曲線分析顯示，miRNA-191和miRNA-21表達(dá)水平對(duì)急性感染期和AIDS期均有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值。因此，miRNA-191和miRNA-21表達(dá)或可作為預(yù)測(cè)HIV急性感染期和AIDS期的臨床指標(biāo)。

綜上所述，HIV/AIDS患者PBMC中 miRNA-191和miRNA-21的表達(dá)與HIV病毒復(fù)制相關(guān)，且兩者對(duì)HIV急性感染期和AIDS期患者具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值，有望成為HIV/AIDS患者診療的新靶點(diǎn)。