于 卓 良，李 德 陽，陰 法 文,2，周 大 勇,2

(1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心,遼寧 大連 116034)

0 引 言

口蝦蛄(Oratosquillaoratoria)作為甲殼綱、口足目動物的代表物種，在我國沿海水域廣泛分布[1]。口蝦蛄風(fēng)味獨特，并富含蛋白質(zhì)、磷、微量元素以及人體必需氨基酸，營養(yǎng)價值高[2]。在蝦類的加工過程中，占整蝦質(zhì)量45%～60%的副產(chǎn)物被浪費或者低效利用[3]。為了減少環(huán)境污染，提高加工產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益，近幾年來關(guān)于各種甲殼類動物副產(chǎn)物中蛋白質(zhì)(肽)、殼聚糖及蝦青素的開發(fā)利用研究常被報道[4-7]。

海洋蝦類脂質(zhì)中富含n-3 PUFA[8]，尤其是二十碳五烯酸(EPA，20：5n-3)和二十二碳六烯酸(DHA，22：6n-3)，在人類營養(yǎng)、疾病預(yù)防和保健中起著至關(guān)重要的作用[9-10]。食品中的n-3 PUFA主要以甘油三酯(TAG)和磷脂(PL)形式存在。與TAG型n-3 PUFA相比，PL型的n-3 PUFA因具有更高的生物利用度、組織輸送能力和生物活性而受到越來越多的關(guān)注[11-12]。研究表明，口蝦蛄脂質(zhì)中富含n-3 PUFA[13]，然而對于其可食部位以及副產(chǎn)物中磷脂分子種類的詳細描述尚未見報道。

本研究主要表征口蝦蛄肌肉和副產(chǎn)物的脂質(zhì)特征，包括脂質(zhì)質(zhì)量分數(shù)、蝦青素質(zhì)量分數(shù)、脂質(zhì)組成、磷脂組成、脂肪酸組成以及磷脂分子種等脂質(zhì)信息，為深入揭示口蝦蛄的營養(yǎng)價值以及口蝦蛄加工副產(chǎn)物的開發(fā)利用前景提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

新鮮口蝦蛄(Oratosquillaoratoria)，30～35只/kg，雌雄各半，無子，大小均一，大連新長興水產(chǎn)品市場；甘油磷脂標準品，美國Avanti Polar Lipids公司；甲醇、氯仿、乙腈、正己烷、二氯甲烷等，色譜級，美國Spectrum Chemical公司；氘代氯仿、氘代甲醇、磷酸三乙酯、碳酸銫、重水，上海阿拉丁試劑有限公司；其他分析級試劑，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2KBTES-55冷凍干燥機，美國VirTis公司；Iatroscan MK-6S棒狀薄層色譜-氫火焰離子化檢測器，日本Iatron公司；Avance Ⅲ 400MHz Bruker核磁共振波譜儀，德國Bruker公司；Agilent 7890A氣相色譜串聯(lián)5977A質(zhì)譜檢測器，美國Agilent公司；Shimadzu LC-20AD高效液相色譜串聯(lián)SPD-M20A DAD檢測器，日本Shimadzu公司；API 4000 Qtrap三重四極桿線性離子阱(QqLIT)質(zhì)譜儀，美國AB Sciex公司。

1.3 方 法

1.3.1 樣品處理

將3 kg口蝦蛄手工分為肌肉與副產(chǎn)物(頭部、甲殼和尾部)兩部分后冷凍干燥72 h，經(jīng)高速粉碎機粉碎后得到口蝦蛄肌肉和副產(chǎn)物干粉，真空密封后在-30 ℃冰箱中冷藏備用。

1.3.2 總脂提取

根據(jù)Blight等[14]的方法，分別提取口蝦蛄副產(chǎn)物與肌肉干粉的總脂，在-80 ℃下貯藏，并在兩周內(nèi)用以分析檢測。

1.3.3 脂質(zhì)組成分析

采用MK-6S棒狀薄層色譜-氫火焰離子化檢測器(TLC-FID)對脂質(zhì)組成進行測定[15]。檢測參數(shù)：氫氣體積流量160 mL/min，空氣體積流量2 L/min，掃描速度每根色譜棒30 s，利用分析軟件采用歸一化方法計算各組分相對質(zhì)量分數(shù)。

1.3.4 脂肪酸分析

采用GC-MS聯(lián)用儀，配置HP-5-MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)對脂肪酸組成和相對質(zhì)量分數(shù)進行測定[15]。載氣為氦氣，壓力保持在48.95 kPa。進樣量1 μL，分流比50∶1。MS條件為EI源(70 eV)，溶劑延遲4 min。脂肪酸甲酯通過比較保留時間，標準品和NIST08質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫來鑒定，并通過峰面積歸一化計算脂肪酸相對質(zhì)量分數(shù)。

1.3.5 磷脂組成分析

采用核磁共振波譜儀(31P-NMR)檢測磷脂類組成[16]，使用MestReNova 6.1.1軟件對各磷脂成分的峰進行積分。利用積分后峰面積與標準品對比，通過歸一化對磷脂組成進行量化得到摩爾分數(shù)。

1.3.6 蝦青素質(zhì)量分數(shù)的測定

采用LC-SPD對蝦青素質(zhì)量分數(shù)進行測定[17-18]，配置C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm)。梯度洗脫分兩相進行：體積比85.0∶5.0∶4.5∶5.5的甲醇、二氯甲烷、水、乙腈溶液A；體積比28.0∶22.0∶4.5∶45.5的甲醇、二氯甲烷、水、乙腈溶液B。洗脫程序：0～8 min，不加溶液B；8～32 min，0～100%溶液B；進樣量10 μL；總體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；在220～650 nm范圍內(nèi)進行三維色譜分析；測定蝦青素所用波長為484 nm，蝦青素保留時間由蝦青素標準品光譜決定。蝦青素峰面積計算公式：

A=A1+1.1A2+1.3A3

式中：A1、A2、A3分別為樣品溶液中反式蝦青素、9-順式-蝦青素和13-順式-蝦青素的峰面積響應(yīng)值，1.1和1.3為9-順式-蝦青素和13-順式-蝦青素對反式蝦青素的相對響應(yīng)系數(shù)。

1.3.7 甘油磷脂分子種分析

根據(jù)文獻[19-21]的方法，采用裝配了Turbo V電噴霧電離源(ESI)質(zhì)譜儀進行甘油磷脂分子種的定性和定量分析，使用HPLC-MS分析軟件1.6.1進行數(shù)據(jù)處理。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行分析。結(jié)果用(平均值±標準差)(SD)表示，采用單因素方差分析評價平均值之間的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂質(zhì)特征的分析

2.1.1 脂質(zhì)質(zhì)量分數(shù)、蝦青素質(zhì)量分數(shù)及脂質(zhì)組成

由表1可見，凍干口蝦蛄肌肉中的脂質(zhì)質(zhì)量分數(shù)明顯高于副產(chǎn)物，脂質(zhì)中蝦青素(AST)質(zhì)量分數(shù)明顯低于副產(chǎn)物。在其他品種蝦中也發(fā)現(xiàn)這種特征[8，22]。從肌肉和副產(chǎn)物中提取的脂質(zhì)由磷脂(PL)、甘油三酯(TAG)、甘油二酯(DAG)、單甘油酯(MAG)、膽固醇(CHO)、游離脂肪酸(FFA)組成。其中PL質(zhì)量分數(shù)最高，TAG和CHO次之。與肌肉脂質(zhì)相比，副產(chǎn)物脂質(zhì)中的PL和CHO質(zhì)量分數(shù)略高，而TAG質(zhì)量分數(shù)略低。前期研究結(jié)果表明，PL在斑結(jié)竹對蝦(Penaeusmonodon)和凡納濱對蝦(Litopenaeusvanname)的脂質(zhì)組成中質(zhì)量分數(shù)最高[23-25]，而在Penaeusmonodon和雄性北極甜蝦(Pandalusmontagui)脂質(zhì)中有與口蝦蛄相似的CHO質(zhì)量分數(shù)[24，26]。

表1 口蝦蛄肌肉和副產(chǎn)物干基的脂質(zhì)質(zhì)量分數(shù)、蝦青素質(zhì)量分數(shù)及脂質(zhì)組成Tab.1 Lipid content,astaxanthin content and lipid class compositions from two parts of Oratosquilla oratoria %

2.1.2 磷脂組成

由表2可見，口蝦蛄肌肉和副產(chǎn)物中均檢測到磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)。其中，PC和PE是肌肉及副產(chǎn)物PL的主要成分。之前的研究結(jié)果也顯示，海洋蝦類磷脂包含PC、PE、PS、PI、LPC[27-28]。其中，Penaeuskerathurus肌肉和頭部的磷脂中PC與PE的質(zhì)量分數(shù)與本研究結(jié)果相近。不同種類的PL其極性頭部不同，營養(yǎng)價值也不同。

表2 口蝦蛄肌肉和副產(chǎn)物的磷脂類組成的摩爾分數(shù)Tab.2 Molecular fractions of phospholipids (mole fraction) in muscle and by-products recovered from different parts of Oratosquilla oratoria %

2.1.3 脂肪酸組成

由表3可見，口蝦蛄脂質(zhì)中多不飽和脂肪酸(PUFA)質(zhì)量分數(shù)最高，尤其是EPA和DHA。其中，口蝦蛄副產(chǎn)物脂質(zhì)的多不飽和脂肪酸所占總脂肪酸比例顯著高于肌肉?？谖r蛄脂質(zhì)中單不飽和脂肪酸(MUFA)質(zhì)量分數(shù)皆高于飽和脂肪酸(SFA)。Balzano等研究了蝦蛄可食部的脂肪酸組成，結(jié)果表明，PUFA占總脂肪酸質(zhì)量分數(shù)為(40.19±3.37)%，是蝦蛄可食部的主要脂肪酸，與本研究結(jié)果相似[13]?？梢?，口蝦蛄副產(chǎn)物是一種容易被忽視的n-3 PUFA來源，具有潛在的開發(fā)價值。

表3 口蝦蛄肌肉和副產(chǎn)物脂質(zhì)中的脂肪酸組成Tab.3 Fatty acid compositions of the lipids recovered from different parts of shrimps Oratosquilla oratoria %

2.2 口蝦蛄副產(chǎn)物和肌肉的甘油磷脂分子種特征

使用三重四極桿質(zhì)譜基于正離子模式下選擇離子掃描鑒定口蝦蛄兩部分脂質(zhì)的甘油磷脂(GPL)分子種，如圖1所示。通過m/z=184的母離子掃描(PIS)選擇性檢測甘油磷脂酰膽堿(GPCho)和溶血甘油磷脂酰膽堿(LGPCho)的甘油磷脂分子種(圖1(a))，而甘油磷脂酰乙醇胺(GPEtn)/溶血甘油磷脂酰乙醇胺(LGPEtn)以及甘油磷脂酰絲氨酸(GPSer)/溶血磷脂酰絲氨酸(LGPSer)則分別通過選擇m/z=141和185的中性丟失掃描選擇性鑒定其分子種(圖1(b)、(c))。甘油磷脂分子種通過特征性掃描得到一階質(zhì)譜信息。根據(jù)之前推導(dǎo)的公式，可以推導(dǎo)出GPL中酯化FA的碳原子和雙鍵的總數(shù)，并通過二級質(zhì)譜掃描，推測sn-1和sn-2位置上FA的具體結(jié)構(gòu)信息，同時對縮醛甘油磷脂(磷脂酰醚酯和磷脂酰烯醇酯)進行結(jié)構(gòu)鑒定[19-21]。此外，以正離子模式下的甘油磷脂的一階質(zhì)譜信號強度與相應(yīng)內(nèi)標的信號強度之比來表示其相對的比較量。

(a) 一級質(zhì)譜m/z=184

口蝦蛄肌肉和副產(chǎn)物的主要甘油磷脂分子種測定結(jié)果見表4。在肌肉和副產(chǎn)物脂質(zhì)中分別檢測到97和102種分子種，其中包括GPCho、GPEtn、GPSer、LGPCho、LGPEtn和LGPSer。在口蝦蛄肌肉和副產(chǎn)物脂質(zhì)的GPCho、GPEtn、GPSer中，16：0/20：5、18：0/20：5、16：0/22：6、18：0/22：6、20：4/20：5、14：0/20：4等是磷脂酰酯的主要分子種，18：4/18：0、20：1/18：0等可能是磷脂酰醚酯的主要分子種，16：0/16：0、18：3/18：0、20：0/18：0等可能是磷脂酰烯醇酯的主要分子種。Balzano等[13]報道Penaeuskerathuru的PC富含PUFA，尤其是EPA。本研究也發(fā)現(xiàn)口蝦蛄肌肉和副產(chǎn)物中也含有豐富的縮醛磷脂。以往的研究也表明，魚類、貝類、甲殼類等海產(chǎn)品中脂質(zhì)的縮醛磷脂質(zhì)量分數(shù)豐富[29]。

表4 口蝦蛄肌肉和副產(chǎn)物脂質(zhì)中的主要甘油磷脂分子種Tab.4 Major glycerophospholipids in muscle and by-product lipids of Oratosquilla oratoria

續(xù)表

3 結(jié) 論

口蝦蛄肌肉干基的脂質(zhì)質(zhì)量分數(shù)明顯高于副產(chǎn)物，而蝦青素質(zhì)量分數(shù)在口蝦蛄副產(chǎn)物脂質(zhì)中比肌肉中更高，分別為(2.09±0.08)和(0.9±0.01)μg/g?？傊|(zhì)由TAG、DAG、MAG、PL、FFA、CHO組成，其中PL最高，占總脂質(zhì)質(zhì)量分數(shù)61.57%～73.60%；TAG和CHO次之，與肌肉相比副產(chǎn)物脂質(zhì)中的PL和CHO占比更高，TAG占比較低?？谖r蛄磷脂以PC和PE為主，摩爾分數(shù)分別為55.54%～61.11%和30.79%～24.86%，并且含有少量的PI、PS、LPC。PUFA是口蝦蛄脂質(zhì)的主要脂肪酸，以EPA和DHA為主，分別占總脂肪酸質(zhì)量分數(shù)12.37%～15.06%和13.89%～13.99%。檢測到口蝦蛄副產(chǎn)物和肌肉中大約200個甘油磷脂分子種，其中主要分子種富含EPA和DHA?？梢?，口蝦蛄脂質(zhì)的營養(yǎng)價值較高，而口蝦蛄副產(chǎn)物作為磷脂型n-3 PUFA的來源，具有潛在的開發(fā)價值。