陸吉麟 張浩 石偉 崔小紅 岳增輝 王永勇 伊萌

[摘要] 目的 探討重組人5型腺病毒注射液局部瘤內(nèi)注射治療晚期肝癌的臨床療效及安全性。 方法 選擇2009年1月至2013年1月來自復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院的80例晚期肝癌患者，分為對照組（n=40）和觀察組（n=40），對照組患者只給予順鉑及5-氟尿嘧啶化療，觀察組患者在化療基礎(chǔ)上聯(lián)合B超引導(dǎo)下經(jīng)皮瘤內(nèi)注射重組人5型腺病毒注射液，連續(xù)使用兩個周期。比較兩組患者腫瘤客觀有效率、腫瘤進(jìn)展時間及不良反應(yīng)。 結(jié)果 觀察組的客觀有效率為22.50%，高于對照組的5.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。觀察組的平均腫瘤進(jìn)展時間為（11.93±2.54）周，高于對照組的（8.06±2.21）周，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。局部瘤內(nèi)注射后48 h觀察組血液中IFN-γ、IL-1α、IL-6及TNF-α顯著高于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。兩組患者治療后ALT、AST、ALP、TBIL及AFP指標(biāo)均有所下降，而觀察組下降幅度大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。觀察組患者不良反應(yīng)主要為發(fā)熱、局部反應(yīng)及流感樣癥狀，均為Ⅰ/Ⅱ級。觀察組患者生活質(zhì)量提高率為55.00%，高于對照組的22.50%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 晚期肝癌患者在化療基礎(chǔ)上局部瘤內(nèi)注射重組人5型腺病毒注射液，可提高客觀有效率和患者生存期，且安全性及耐受性好。

[關(guān)鍵詞] 肝癌;腺病毒;重組人5型腺病毒;基因療法

[中圖分類號] R738.6;R730.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）12-0010-06

Clinical research on topical intratumoral injection of recombinant human adenovirus type 5 in the treatment of advanced liver cancer

LU Jilin1? ?ZHANG Hao1? ?SHI Wei1? ?CUI Xiaohong2? ?YUE Zenghui2? ?WANG Yongyong2? ?YI Meng3

1.Department of General Surgery， Huashan Hospital Affiliated to Fudan University， Shanghai? ?200050， China; 2.Department of General Surgery， Shanghai Electric Power Hospital， Shanghai 200031， China; 3.Shanghai Sunway Biotech Co.，LTD， Shanghai? ?200052， China

[Abstract] Objective To investigate the clinical efficacy and safety of intratumoral injection of recombinant human adenovirus type 5 in the treatment of advanced liver cancer. Methods A total of 80 patients with advanced liver cancer admitted to Huashan Hospital Affiliated to Fudan University from January 2009 to January 2013 were selected， and they were divided into the control group（n=40） and the observation group （n=40）. The patients in the control group were only treated with cisplatin and fluorouracil chemotherapy， while those in the observation group were treated with recombinant human adenovirus type 5 injection on the basis of chemotherapy combined with B-ultrasound guided percutaneous injection for two consecutive cycles. The objective efficacy rate， tumor progression time and adverse reactions （ADRs） of the two groups of tumors were compared. Results The objective efficacy rate in the observation group was 22.50%， which was higher than that of 5.00% in the control group， with statistically significant difference （P<0.05）. The tumor progression time in the observation group was （11.93±2.54） weeks， which was higher than that of （8.06±2.21） weeks in the control group，with statistically significant difference（P<0.05）. The blood levels of IFN-γ， IL-1α， IL-6 and TNF-α in the observation group 48 h after topical intratumoral injection were significantly higher than those before injection（P<0.05）. After treatment， the index levels of ALT， AST， ALP， TBIL and AFP all decreased in both groups， while the decrease in the observation group was greater than that in the control group， with statistically significant difference（P<0.05）. The main ADRs in the observation group were fever， topical reactions and influenza like symptoms， all of which were grade Ⅰ/Ⅱ. The improvement rate of quality of life in the observation group was 55.00%， which was higher than that of 22.50% in the control group，with statistically significant difference（P<0.05）. Conclusion Topical intratumoral injection of recombinant human adenovirus type 5 on the basis of chemotherapy for patients with advanced liver cancer can improve the objective efficacy rate and survival time of patients， with good safety and tolerance.

[Key words] Liver cancer; Adenovirus; Recombinant human adenovirus type 5; Gene therapy

肝癌具有極高的發(fā)病率和死亡率，是嚴(yán)重威脅我國人民健康的惡性疾病之一[1]。手術(shù)切除是肝癌首選的治療手段[2]。但是，我國的肝癌患者多合并有不同程度的肝硬化，很多患者因此失去了手術(shù)機(jī)會。溶瘤腺病毒注射作為一種腫瘤的基因治療方法日益受到關(guān)注[3-4]。重組人5型腺病毒注射液（商品名：安柯瑞）是全球第一個成功上市的溶瘤病毒藥物。重組人5型腺病毒注射液是利用基因工程技術(shù)刪除人5型腺病毒E1B-55kD和E3區(qū)部分基因片段而獲得的一種溶瘤性腺病毒。重組人5型腺病毒注射液用于晚期肝癌治療國內(nèi)尚無報道。本院進(jìn)行臨床試驗(yàn)，分析在化療基礎(chǔ)上聯(lián)合重組人5型腺病毒對肝癌的治療效果，并分析其有效性和安全性，以期為臨床治療提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009年1月至2013年1月于復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院住院治療的80例原發(fā)性肝癌晚期患者為研究對象，其中男47例，女33例。根據(jù)患者是否接受重組人5型腺病毒注射液局部瘤內(nèi)注射治療，將其分為對照組與觀察組，每組各40例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～70歲，經(jīng)病理組織確診的原發(fā)性肝細(xì)胞癌者[5];②預(yù)計生存期>6個月者;③無肝、腎功能嚴(yán)重障礙（Child A和B級患者）、無門靜脈主干完全阻塞、腫瘤占據(jù)率<70%者。除此之外，觀察組患者尚具備以下標(biāo)準(zhǔn)[5]：①經(jīng)病理組織學(xué)確診的，易于進(jìn)行B超引導(dǎo)下經(jīng)皮肝穿刺腫瘤內(nèi)注射操作的肝癌者;②受試者體力狀況KPS評分≥60分者;③至少有一個適合進(jìn)行瘤內(nèi)注射操作的可評價病灶者。排除標(biāo)準(zhǔn)[5]：①全身情況差，肝功明顯受損者（膽紅素>3倍正常值上限、血清白蛋白<30 g/L）;②妊娠及哺乳期婦女;③有明顯的重要臟器功能受損及血液系統(tǒng)疾病者;④合并其他惡性腫瘤者。觀察組患者尚需排除：①有生物制劑過敏史者;②正在使用抗病毒藥物者及在1個月內(nèi)使用過免疫制劑者?；€時，兩組患者在性別、年齡、Child分期等臨床資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性 。見表1。本研究所有患者均簽署知情同意書，且本研究符合赫爾辛基宣言，并獲得復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 方法

對照組患者靜脈注射5-氟尿嘧啶500 mg/m2（上海旭東海普藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H31020593，批號：00000693，規(guī)格：250 mg/10 mL）和順鉑 20 mg/m2（齊魯制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20023461，批號：00001298，規(guī)格：20 mg）;觀察組患者在對照組化療方法的基礎(chǔ)上，在B超引導(dǎo)下將5支重組人5型腺病毒注射液（上海三維生物技術(shù)有限公司，國藥準(zhǔn)字S20060027，規(guī)格：5.0×1011 VP/0.5 mL/支）生理鹽水稀釋后瘤內(nèi)多點(diǎn)注射，劑量為2.5×1012 VP/d，以14 d為一個周期，連續(xù)使用2個周期。

1.3 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

①試驗(yàn)前檢查：患者KPS評分（Karnofsky score，KPS）、生命體征、血常規(guī)、尿常規(guī)、血生化、凝血功能、細(xì)胞因子、腫瘤標(biāo)志物、心電圖、肝臟B超/計算機(jī)斷層掃描（Computed tomography，CT）/磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）檢查。②試驗(yàn)期間檢查：生命體征、用藥后的體溫監(jiān)測及其他不良反應(yīng)的觀察、腫瘤大小監(jiān)測、腫瘤標(biāo)志物、細(xì)胞因子、病毒定量PCR檢測。對所有患者進(jìn)行隨訪，在2個周期治療結(jié)束后及之后每個月進(jìn)行隨訪直至死亡。比較兩組腫瘤客觀有效率、腫瘤進(jìn)展時間及不良反應(yīng)。兩組療效結(jié)束后4周評定腫瘤客觀有效率，根據(jù)《實(shí)體腫瘤客觀療效評定標(biāo)準(zhǔn)》[6]評定療效，分為完全緩解（Complete remission，CR）、部分緩解（Partial remission，PR）、無變化（No change，NC）和進(jìn)展（Progressive diseas，PD），其中CR+PR為客觀有效率。不良反應(yīng)按NCI毒性分為Ⅰ～Ⅳ級。采用Karnofsky評分[7]評價治療4周后患者的生活質(zhì)量，增加≥10分為提高，減少≥10分為下降，增加或下降不足10分為穩(wěn)定。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，腫瘤進(jìn)展時間用Kaplan-Meier檢驗(yàn)行統(tǒng)計分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者客觀有效率及腫瘤進(jìn)展時間比較

觀察組的客觀有效率（CR+PR）顯著高于對照組（22.50% vs. 5.00%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。觀察組與對照組平均腫瘤進(jìn)展時間分別為（11.93±2.54）周與（8.06±2.21）周，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 兩組患者治療前后病毒數(shù)量及細(xì)胞因子比較

治療前和治療后48 h，對照組患者血液中病毒數(shù)量及細(xì)胞因子干擾素-γ（Interferon γ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）-1α、IL-6和腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）-α的水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與治療前相比，觀察組患者在局部瘤內(nèi)注射重組人5型腺病毒注射液48 h后血液中病毒數(shù)量、IFN-γ、IL-1α、IL-6和TNF-α顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。此外，治療后48 h，觀察組患者的病毒數(shù)量、IFN-γ、IL-1α、IL-6和TNF-α顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.3 重組人5型腺病毒注射液對患者肝功能和腫瘤標(biāo)志物的影響

治療后48 h，兩組患者谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、總膽紅素（Total Bilirubin，TBIL）及甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein，AFP）指標(biāo)較治療前均有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;但觀察組的下降幅度大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 注射重組人5型腺病毒注射液后對患者腫瘤體積變化的影響

觀察組患者治療2個月后復(fù)查CT，有28例患者腫瘤內(nèi)出現(xiàn)不同程度壞死，腫瘤體積縮小，計算機(jī)三維體積重建結(jié)果顯示，治療前后縮小范圍為17.83%～38.92%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而對照組患者治療2個月后復(fù)查CT，僅有4例患者腫瘤內(nèi)出現(xiàn)不同程度壞死，腫瘤體積縮小范圍為4.53%～7.35%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。且治療2個月后，觀察組患者腫瘤體積縮小范圍顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.5觀察組不良反應(yīng)發(fā)生情況

觀察組患者不良反應(yīng)主要為發(fā)熱19例（47.50%）、局部反應(yīng)2例（5.00%），持續(xù)時間<24 h、流感樣癥狀5例（12.50%），均為Ⅰ/Ⅱ級，患者均可耐受，多數(shù)可自行緩解，體溫較高且患者無法耐受時予以對癥治療。

2.6 兩組患者生存率及生活質(zhì)量比較

與對照組相比，觀察組患者生存率顯著增加（P<0.05）。見封三圖2。且觀察組患者生活質(zhì)量提高率為55.00%，高于對照組的22.50%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3討論

基因治療作為一種新的治療方式顯示出了初步療效，且可以延長惡性腫瘤患者的生存期，溶瘤性腺病毒治療是基因治療中最有前途的治療方法之一，通過溶瘤性腺病毒局部注射，病毒可感染腫瘤組織并復(fù)制，最終溶解腫瘤細(xì)胞[8]。目前腺病毒依據(jù)血清分型分為51個不同亞型，均為無包膜病毒，其線性雙鏈DNA約有36 kB，包括早期基因E1-E4及晚期基因L1-L5。溶瘤性腺病毒可用于基因治療腫瘤的主要原因?yàn)閇9]：①溶瘤性腺病毒的生物學(xué)特性適用于基因治療;②對人類相對較低的致病性;③可同時感染分裂細(xì)胞及休眠細(xì)胞;④有能力容納大的基因負(fù)荷;⑤由于病毒很少整合入宿主細(xì)胞，發(fā)生插入誘變的風(fēng)險較低;⑥操作簡單即可獲得較高的病毒產(chǎn)量。

本研究主要探討在化療基礎(chǔ)上聯(lián)合局部瘤內(nèi)注射重組人5型腺病毒對肝癌的治療效果和安全性。實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示，在重組人5型腺病毒注射液局部瘤內(nèi)注射48 h后，病毒數(shù)量顯著擴(kuò)增，使其生物學(xué)功效得以很好地發(fā)揮。觀察組患者客觀有效率顯著高于對照組，平均腫瘤進(jìn)展時間也顯著延長。重組人5型腺病毒注射液是利用基因工程技術(shù)刪除人5型腺病毒E1B-55kD和E3區(qū)部分基因片段，能在p53功能缺陷的腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制，具有復(fù)制依賴性細(xì)胞毒作用，在一定劑量范圍內(nèi)對p53功能缺陷的腫瘤具有明顯的抗腫瘤活性，對正常細(xì)胞則無明顯毒性作用。p53為重要的抑癌基因，可在細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄的同時促發(fā)細(xì)胞凋亡，此外還可抑制腫瘤細(xì)胞的DNA修復(fù)和抗凋亡功能[10-11]。p53蛋白是細(xì)胞生長的負(fù)性調(diào)節(jié)劑，可阻止細(xì)胞周期中G1期細(xì)胞進(jìn)入到S期，使損傷的DNA或染色體有時間修復(fù)。E1B-55kD蛋白可與p53蛋白結(jié)合，抑制p53對病毒的清除。重組人5型腺病毒注射液由于刪除了E1B-55kD而在p53正常的肝細(xì)胞中無法復(fù)制;而在p53基因突變的腫瘤中，病毒由于無p53基因的抑制作用而大量復(fù)制并裂解殺傷細(xì)胞，同時釋放大量子代病毒再感染其他細(xì)胞，從而發(fā)揮靶向殺傷的抗腫瘤作用。最新研究認(rèn)為，溶瘤病毒除了p53途徑之外，還可能與晚期RNA能否轉(zhuǎn)錄出細(xì)胞核相關(guān)，該研究認(rèn)為晚期病毒RNA出核與E1B-55kD相關(guān)，由于溶瘤病毒刪除E1B-55kD，從而限制溶瘤病毒晚期RNA出核，使其無法在正常細(xì)胞中復(fù)制，所以這一過程與p53途徑無關(guān)。而腫瘤細(xì)胞由于遺傳的不穩(wěn)定性，可以彌補(bǔ)E1B-55kD所起的作用，即使病毒刪除了E1B-55kD，病毒晚期mRNA的出核也不受影響，從而可以順利地完成晚期蛋白的翻譯、合成和裝配。E3片段的刪除可使腫瘤抗原信息通過樹突狀細(xì)胞遞呈給人體免疫系統(tǒng)，激活T淋巴細(xì)胞，發(fā)揮全身性抗腫瘤效應(yīng)[12]。E3片段與機(jī)體宿主免疫抑制相關(guān)，宿主免疫可促進(jìn)病毒在腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制和擴(kuò)散[13-14]。病毒感染可激活感染病毒的腫瘤細(xì)胞宿主免疫反應(yīng)，協(xié)助宿主免疫系統(tǒng)識別腫瘤細(xì)胞。同時由于腫瘤晚期，其他部位發(fā)生轉(zhuǎn)移非常常見，某些病灶可能無法進(jìn)行腫瘤局部注射，此時宿主免疫系統(tǒng)的激活則可以使這部分患者治療獲益。目前，該病毒已在其他相關(guān)領(lǐng)域，如體表實(shí)體腫瘤、肺癌、頭頸部及胰腺癌等各期臨床研究中顯示出其優(yōu)良的抗腫瘤效應(yīng)和安全性[15-19]。而本研究結(jié)果提示，在化療的基礎(chǔ)上聯(lián)合局部瘤內(nèi)注射重組人5型腺病毒可以有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死，從而提高治療效果。

觀察組大部分患者出現(xiàn)了TNF-α和IFN-γ等化療增敏細(xì)胞因子的升高，IFN-γ、IL-1α、IL-6及TNF-α等炎癥因子水平的升高可以降低腫瘤細(xì)胞的免疫逃避效應(yīng)，從而發(fā)揮全身性的抗腫瘤效應(yīng)。這些細(xì)胞因子之間、細(xì)胞因子和化療之間、細(xì)胞因子與高體溫之間均可發(fā)生協(xié)同作用，更有利于進(jìn)一步殺死腫瘤細(xì)胞[20]。藥物安全性和不良反應(yīng)是兩個最值得注意的問題。本研究結(jié)果顯示，密切關(guān)注治療和隨訪期間的不良反應(yīng)，本研究中觀察組不良反應(yīng)均為Ⅰ/Ⅱ級，患者均可耐受，多數(shù)可自行緩解，且生活質(zhì)量顯著優(yōu)于對照組?？赡苁怯捎谥亟M人5型腺病毒是一種修飾的溶瘤腺病毒，其中的E1B（E1B-55 kD）基因部分已被刪除，在正常細(xì)胞中的復(fù)制能力受到抑制，從而提高了安全性[21]。

綜上所述，晚期肝癌患者在化療基礎(chǔ)上局部瘤內(nèi)注射重組人5型腺病毒注射液，可提高客觀有效率和患者生存期，且安全性及耐受性好。

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（收稿日期：2020-12-03）