楊賢慧，方霞，劉愛(ài)勝，施俊柱

(1.深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，深圳 518109；2.深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，深圳 518110)

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)又稱早絕經(jīng)，是指曾經(jīng)月經(jīng)周期正常的女性在40歲前出現(xiàn)原因不明的卵巢功能衰竭，主要表現(xiàn)為卵巢萎縮性持續(xù)閉經(jīng)，并伴有雌激素水平降低而促性腺激素水平升高[1-3]。POF病因十分復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，多數(shù)認(rèn)為POF發(fā)病與遺傳、環(huán)境、精神、感染、代謝及自身免疫等諸多因素有關(guān)，其中遺傳因素是POF發(fā)病的主要原因之一[4-5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，POF發(fā)病與多個(gè)基因多個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性有密切關(guān)系，TNF-α基因308G/A位點(diǎn)多態(tài)性就是其中之一，且其基因突變可影響某些細(xì)胞因子和蛋白的表達(dá)水平，從而參與POF疾病的發(fā)生和發(fā)展[6-8]。因此，本研究對(duì)深圳地區(qū)167例POF患者和120例非POF健康育齡婦女TNF-α基因308G/A位點(diǎn)多態(tài)性與TNF-α、TGF-β1水平之間的相關(guān)性進(jìn)行了調(diào)查分析。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2017年4月—2019年5月來(lái)深圳龍華區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)中心就診并確診為POF患者167例，年齡(28.06±9.57)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)[7]：(1)年齡<40周歲，繼發(fā)性閉經(jīng)時(shí)間>6個(gè)月；(2)2次或以上血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)≥40 U/L或黃體生成素(LH)>30 U/L(間隔1個(gè)月以上)；(3)連續(xù)2次雌二醇(estradiol，E2)水平<91.5 pmol/L(2個(gè)月內(nèi))；(4)B超顯示雙側(cè)卵巢萎縮，無(wú)卵泡發(fā)育[7]。排除因其他原因如染色體核型異常、自身免疫性疾病、盆腔手術(shù)史及放化療史等卵巢損害的因素導(dǎo)致卵巢功能低下的患者。同時(shí)選擇同期非POF健康育齡婦女120例，年齡(29.36±10.24)歲，均為因輸卵管或男性不育因素而就診的育齡期婦女，月經(jīng)周期規(guī)律，激素水平、染色體核型、子宮及卵巢功能均正常，排除有卵巢手術(shù)史、放化療史、其他自身免疫性疾病、激素水平紊亂史及重大疾病史的患者。確保兩組婦女的年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意批準(zhǔn)，且所有患者及家屬對(duì)研究?jī)?nèi)容知情并簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑ABI7500 PCR分析儀、Qubit4.0核酸蛋白定量?jī)x由美國(guó)ABI公司提供；DNA提取試劑由深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供；TNF-α和TGF-β1試劑盒由深圳市科潤(rùn)達(dá)生物工程有限公司提供；AE275全自動(dòng)免疫分析儀由深圳愛(ài)康科技有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 清晨采用一次性采血針采集所有研究對(duì)象空腹靜脈血2份，其中一份3～4 mL于無(wú)抗凝劑的干燥管內(nèi)分離血清，用于TNF-α和TGF-β1水平測(cè)定；另一份2～3 mL于抗凝管內(nèi)混勻，于-70 ℃冰箱內(nèi)保存，用于DNA提取。

1.3.2 TNF-α、TGF-β1水平測(cè)定 采用ELISA檢測(cè)血清TNF-α和TGF-β1水平，檢測(cè)前對(duì)所有相關(guān)儀器進(jìn)行保養(yǎng)和校正，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒、儀器說(shuō)明書及科室SOP操作規(guī)程進(jìn)行，由相同的專業(yè)人員進(jìn)行成批檢測(cè)，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性。

1.3.3 DNA提取 采用深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供的全血基因組DNA提取試劑盒提取外周血白細(xì)胞中的DNA，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒及儀器說(shuō)明書進(jìn)行。提取后的DNA濃度和純度采用核酸熒光蛋白定量?jī)x進(jìn)行檢測(cè)，將符合要求的DNA標(biāo)本置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4TNF-α基因308G/A位點(diǎn)多態(tài)性分析 檢測(cè)步驟為(1)引物設(shè)計(jì)：上游5＇-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3＇，下游5＇-TCCTCCCTGCTCCGATTCCCG-3＇。(2)PCR反應(yīng)體系：總反應(yīng)體系為25 μL，其中DNA模板5 μL，Go Tag混合酶12.5 μL(包括Taq DNA聚合酶，dNTP，10×PCR緩沖液)，正、反向引物各0.25 μL，加入無(wú)菌去離子水至25 μL后混勻。(3)PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共反復(fù)循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。(4)限制性酶切：取25 μL PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，加入25 μL限制性內(nèi)切酶NcoⅠ，1 μL的10×核苷酸緩沖液(nucleotide buffer，NEB)，0.1 μL的100×牛血清白蛋白，用無(wú)菌去離子水加至100 μL，混勻，于65 ℃水浴2 h。(5)電泳：取10 μL酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后判讀酶切結(jié)果。

1.3.5 判讀標(biāo)準(zhǔn) GG基因型，于87和20 bp 處出現(xiàn)2條電泳帶；GA基因型，于107、87和20 bp處出現(xiàn)3條電泳帶；AA基因型，僅于107 bp處出現(xiàn)1條電泳帶。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)POF組和對(duì)照組患者TNF-α基因308G/A位點(diǎn)均檢測(cè)出GG、GA和AA 3種基因型，2組的基因型頻率經(jīng)Hardy-Weinberg檢驗(yàn)，均符合Hardy-Weinberg平衡，研究對(duì)象選擇均符合隨機(jī)抽樣，具有樣本代表性。

2.2 兩組血清TNF-α、TGF-β1水平的比較POF組患者血清TNF-α和TGF-β1水平分別為(9.02±3.28)pg/mL和(197.24±18.75)pg/mL，明顯低于對(duì)照組[(21.59±6.86)pg/mL和(463.69±62.54)pg/mL](t=3.872 5、4.972 1，均P<0.05)。

2.3 兩組血清TNF-α基因308 G/A位點(diǎn)基因型及等位基因檢出率的比較POF組患者血清TNF-α基因308G/A位點(diǎn)GG基因型及G等位基因檢出率分別為85.03%和90.12%，明顯高于對(duì)照組(62.50%和73.33%)(均P<0.05)。(表1)

表1 POF組與對(duì)照組TNF-α基因308 G/A位點(diǎn)基因型及等位基因檢出率的比較

2.4 不同基因型POF患者血清TNF-α、TGF-β1水平的比較TNF-α基因308G/A位點(diǎn)GG基因型的POF患者血清TNF-α和TGF-β1水平分別為(8.24±3.06)pg/mL和(172.57±15.04)pg/mL，明顯低于GA和AA基因型(均P<0.05)。(表2)

表2 不同基因型POF患者血清TNF-α、TGF-β1水平的比較

3 討論

POF是指卵巢功能衰竭所致婦女40歲前出現(xiàn)原發(fā)性或繼發(fā)性閉經(jīng)，并伴有促性腺激素水平升高和雌激素水平降低的一種疾病，是女性卵巢常見(jiàn)疾病之一，全球發(fā)病率約為1%，我國(guó)為1%～3.8%，且呈逐年上升趨勢(shì)[9-11]。POF常伴有潮熱、多汗、面部潮紅及性欲低下等一系列不同程度的低雌激素癥狀，是導(dǎo)致女性不孕的常見(jiàn)原因之一，嚴(yán)重影響患者生育能力、生活質(zhì)量和家庭和諧[12-13]。但POF病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚未明確，給POF治療及預(yù)防帶來(lái)了很大的挑戰(zhàn)[14-15]。因此，加大POF發(fā)病機(jī)制及影響因素的深入和廣泛的研究，極具必要性。

TNF-α主要是由內(nèi)毒素激活的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及卵泡的顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要炎性細(xì)胞因子，其可促使顆粒細(xì)胞表達(dá)主要MHC抗原，以致激活體液免疫和細(xì)胞免疫介導(dǎo)的抗卵巢自身免疫應(yīng)答，引起卵泡破壞，導(dǎo)致卵巢早衰[16-17]。而TGF-β1是TGF-β超家族中的一個(gè)亞型，以自分泌或旁分泌的方式通過(guò)Smad蛋白家族廣泛地表達(dá)于不同時(shí)期卵泡的顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞，在卵泡的生長(zhǎng)、發(fā)育、閉鎖及卵細(xì)胞發(fā)育成熟等方面都發(fā)揮了重要的作用，與卵巢功能密切相關(guān)[18-19]。本研究結(jié)果顯示，POF患者血清TNF-α和TGF-β1水平明顯低于非POF育齡婦女(均P<0.05)，與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[8，16，18-19]，TNF-α水平降低可能與其某些基因位點(diǎn)易突變有關(guān)，而TGF-β1水平降低可能與POF患者的卵巢組織萎縮、顆粒細(xì)胞減少，甚至消失有關(guān)。

POF是一種復(fù)雜性遺傳性疾病，與多種基因突變有關(guān)，但其遺傳機(jī)制仍不清楚[20-22]。有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)突變可影響TNF的產(chǎn)生，從而使不同個(gè)體之間TNF-α水平出現(xiàn)明顯差異，并參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[8，16]。本研究結(jié)果顯示，深圳地區(qū)POF患者TNF-α基因308G/A位點(diǎn)GG基因型及G等位基因檢出率明顯高于非POF人群(均P<0.05)，這表明TNF-α基因308G/A位點(diǎn)SNP突變可能與POF發(fā)病有關(guān)，與有關(guān)報(bào)道一致[8]。同時(shí)本研究結(jié)果還顯示，攜帶GG基因型的POF患者TNF-α和TGF-β1水平明顯低于其他基因型(均P<0.05)，這可能與TNF-α基因308G/A位點(diǎn)SNP突變直接或間接從轉(zhuǎn)錄水平上影響TNF-α和TGF-β1分泌等因素有關(guān)，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，POF患者TNF-α和TGF-β1水平明顯降低，而TNF-α基因308G/A位點(diǎn)GG基因型及G等位基因檢出率明顯升高，且不同基因型POF患者TNF-α和TGF-β1水平之間存在很大差異。由此可見(jiàn)，TNF-α基因308G/A位點(diǎn)的SNP可能與深圳地區(qū)POF發(fā)病有密切關(guān)系，其中GG基因型可能是POF發(fā)病的易感危險(xiǎn)遺傳基因之一。