王成，金衛(wèi)東，郭長磊，李霞，劉振，韓明磊，侯永蘭，崔佳佳

(1.新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 心血管內(nèi)一科，新鄉(xiāng) 453000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，新鄉(xiāng) 453000)

心血管系統(tǒng)疾病，如心力衰竭、心肌缺血再灌注損傷、冠狀動脈微栓塞等常常伴有心肌組織炎癥反應，嚴重威脅著人們的健康及生命。TNF-α是機體內(nèi)關鍵的炎性因子，促進心力衰竭、動脈粥樣硬化等心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展，誘導心肌細胞損傷[1]。具體而言，心肌組織中高水平的TNF-α可誘導心肌細胞損傷，促進細胞凋亡，破壞心肌組織結(jié)構[2]。髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)可激活NF-κB，引起其高表達，釋放一系列炎癥介質(zhì)，破壞心臟局部免疫平衡，最終引起炎性因子的大量釋放，觸發(fā)炎癥反應，致使心肌細胞凋亡等[3]。已有研究表明，MyD88 敲除小鼠在腎臟和心肌缺血再灌注過程中由炎癥反應導致的組織損傷和臟器功能紊亂明顯減輕[4]，沉默MyD88可抑制IEC-6細胞凋亡改善腸道炎癥性疾病病情[5]，故推測沉默MyD88表達可有效改善心肌炎癥。目前還沒有有關沉默MyD88對TNF-α誘導的心肌細胞炎癥反應相關研究，本研究以此為切入點探究沉默MyD88抑制NF-κB p65活化對TNF-α誘導的心肌細胞凋亡和炎癥損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑DMEM培養(yǎng)液、青-鏈霉素、FBS和胰蛋白酶，購自Gibco公司；shRNA-MyD88慢病毒及對照慢病毒shRNA-NC，購自上海吉瑪制藥技術有限公司；5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2′-deoxyuridine, BrdU)細胞增殖檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，購自碧云天生物技術研究所；肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase MB，CK-MB)測試盒、肌紅蛋白(myohemoglobin，Mb)測試盒、肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ，cTnⅠ)測試盒、IL-1β測試盒、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)分型測試盒、IL-6測試盒和IL-10測試盒，購自南京建成生物工程研究所；兔抗人MyD88、Ki67、Bax、Bcl-2、c-Myc、NF-κB p65單克隆抗體，購自Abcam公司。

1.2 實驗細胞人H9C2細胞，購自美國菌種保藏中心。將H9C2細胞培養(yǎng)于含10% FBS和1 %青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3 d更換1次培養(yǎng)液，實驗時用0.25%胰蛋白酶消化收集對數(shù)生長期細胞。

1.3 細胞的處理與分組[6]接種對數(shù)生長期的H9C2細胞于24孔板，細胞鋪底率為50%時用含10% FBS的DMEM稀釋shRNA-MyD88慢病毒和對照慢病毒，加至24孔板。于培養(yǎng)孔內(nèi)添加5 μg/mL的聚凝胺，混勻培養(yǎng)12 h后更換細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d后用嘌呤霉素篩選10 d，即得到穩(wěn)定感染的細胞株。將細胞隨機分為4組：取穩(wěn)定感染shRNA-MyD88慢病毒的H9C2細胞，用含20 μg/L TNF-α的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，記為TNF-α+sh-MyD88組；用含20 μg/L TNF-α的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)穩(wěn)定感染對照慢病毒的H9C2細胞24 h，記為TNF-α+shRNA-NC組；用含20 μg/L TNF-α的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)未感染的H9C2細胞24 h，記為TNF-α組；以不受任何處理的H9C2細胞為Control組。

1.4 Western blotting檢測各組細胞MyD88及NF-κB信號通路蛋白表達水平用PBS漂洗各組細胞3次，再加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液裂解細胞提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)水平。提取等量的蛋白樣本(20 mg)，100 ℃變性5 min。SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5% BSA室溫封閉1～2 h后加入相應的一抗(1∶1 000)，4 ℃過夜孵育。次日，向PBS漂洗后樣本中加入抗IgG-HRP二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，漂洗。最后加入化學發(fā)光液后，于凝膠成像儀曝光攝片，并用ImageJ軟件統(tǒng)計灰度值計算蛋白的相對表達量。實驗以GAPDH為參照蛋白，操作至少獨立重復3次。

1.5 ELISA檢測各組細胞上清液心肌損傷因子和細胞因子水平將H9C2細胞按3×105個/mL、100 μL/孔體積加至96孔酶標板，按1.3方法分組。收集各組細胞培養(yǎng)上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測CK-MB、Mb、cTnⅠ、IL-1β、iNOS、IL-6和IL-10水平，用酶標儀測定光密度D(450 nm)值。

1.6 FACS檢測各組心肌細胞凋亡情況收集心肌細胞懸液至10 mL離心管中，每份樣本的細胞密度為3×106個/mL(2 mL/孔)，800×g離心5 min；棄去培養(yǎng)液，用孵育緩沖液漂洗1次，800×g離心5 min；用100 μL Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液重懸細胞，室溫條件下避光孵育10～15 min，800×g離心5 min；用孵育緩沖液漂洗細胞沉淀1次，加入熒光溶液(SA-FLOUS)4 ℃條件下孵育20 min，避光反應并持續(xù)搖晃反應液，F(xiàn)CM檢測并通過CytExpert軟件分析檢測結(jié)果。

1.7 BrdU染色檢測各組心肌細胞增殖情況將轉(zhuǎn)染后的細胞傳代接種于6孔板，待細胞鋪底率達80%時，用含0.4% FBS的培養(yǎng)液孵育72 h；加入終濃度為0.03 μg/mL的BrdU繼續(xù)孵育40 min，PBS漂洗細胞3次，多聚甲醛固定10 min；嚴格按照說明書操作檢測心肌細胞增殖能力，鏡下觀察并計數(shù)BrdU染色陽性細胞數(shù)。

1.8 RT-PCR檢測心肌細胞增殖、凋亡相關基因mRNA水平TRIzol法提取H9C2細胞總RNA，用NanoDrop分光光度計測定光密度[D(260 nm)/D(280 nm)]比值。按照試劑盒說明書合成cDNA并完成PCR擴增，反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共擴增35個循環(huán)；72 ℃延長10 min。于4 ℃條件下保存反應產(chǎn)物，通過2%瓊脂糖凝膠電泳分離目標蛋白。

2 結(jié)果

2.1 沉默MyD88表達下調(diào)TNF-α誘導的心肌細胞MyD88蛋白表達水平Western blotting檢測各組細胞MyD88蛋白表達水平。結(jié)果顯示，與Control組相比，TNF-α組MyD88蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與TNF-α+shRNA-NC組相比，TNF-α+sh-MyD88組MyD88蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。(圖1)

注：1. Control組；2. TNF-α組；3. TNF-α+shRNA-NC組；4. TNF-α+sh-MyD88組。與Control組相比，*P<0.05；與TNF-α+shRNA-NC組相比，#P<0.05。圖1 沉默MyD88表達對TNF-α誘導的心肌細胞MyD88蛋白表達水平的影響

2.2 沉默MyD88表達降低TNF-α誘導的心肌細胞上清液CK-MB、Mb及cTnⅠ水平ELISA檢測各組細胞上清液CK-MB、Mb及cTnⅠ水平。結(jié)果顯示，與Control組相比，TNF-α組CK-MB、Mb、cTnⅠ含量顯著升高(P<0.05); 與TNF-α+shRNA-NC組相比，TNF-α+sh-MyD88組CK-MB、Mb及cTnⅠ含量顯著降低(P<0.05)。(表1)

表1 沉默MyD88表達對TNF-α誘導的心肌細胞CK-MB、Mb及cTnⅠ水平的影響

2.3 沉默MyD88表達抑制TNF-α誘導的心肌細胞凋亡FACS檢測各組心肌細胞凋亡情況。結(jié)果顯示，與Control組相比，TNF-α組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與TNF-α+shRNA-NC組相比，TNF-α+sh-MyD88組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。(圖2)

注：A. FACS檢測心肌細胞凋亡情況；B. 各組心肌細胞凋亡率直方圖。1. Control組；2. TNF-α組；3. TNF-α+shRNA-NC組；4. TNF-α+sh-MyD88組。與Control組相比，*P<0.05；與TNF-α+shRNA-NC組相比，#P<0.05。圖2 沉默MyD88表達對TNF-α誘導的心肌細胞凋亡的影響

2.4 沉默MyD88表達促進TNF-α誘導的心肌細胞增殖BrdU染色檢測各組心肌細胞增殖情況。結(jié)果顯示，與Control組相比，TNF-α組BrdU染色陽性細胞數(shù)顯著減少(P<0.05)；與TNF-α+shRNA-NC組相比，TNF-α+sh-MyD88組BrdU染色陽性細胞數(shù)顯著增加(P<0.05)。(圖3)

注：A. BrdU染色檢測心肌細胞增殖情況(×200)；B. 各組BrdU染色陽性細胞數(shù)直方圖。1. Control組；2. TNF-α組；3. TNF-α+shRNA-NC組；4. TNF-α+sh-MyD88組。與Control組相比，*P<0.05；與TNF-α+shRNA-NC組相比，#P<0.05。圖3 沉默MyD88表達對TNF-α誘導的心肌細胞增殖的影響

2.5 沉默MyD88表達增加TNF-α誘導的心肌細胞Ki67、c-MycmRNA水平和Bcl-2mRNA/BaxmRNA比值通過RT-PCR檢測各組細胞Ki67、Bcl-2、Bax、c-MycmRNA水平。結(jié)果顯示，與Control組相比，TNF-α組Ki67、c-MycmRNA水平和Bcl-2 mRNA/BaxmRNA比值顯著降低(均P<0.05); 與TNF-α+shRNA-NC組相比，TNF-α+sh-MyD88組Ki67、c-MycmRNA水平和Bcl-2 mRNA/BaxmRNA比值顯著升高(均P<0.05)。(表2)

表2 沉默MyD88表達對TNF-α誘導的心肌細胞Ki67、c-Myc mRNA水平和Bcl-2mRNA/Bax mRNA比值的影響

2.6 沉默MyD88表達降低TNF-α誘導的心肌細胞IL-1β、iNOS和IL-6水平，增加IL-10水平通過ELISA檢測各組細胞IL-1β、iNOS、IL-6和IL-10含量。結(jié)果顯示，與Control組相比，TNF-α組IL-1β、iNOS、IL-6含量顯著升高(均P<0.05)； 與TNF-α+shRNA-NC組相比，TNF-α+sh-MyD88組IL-1β、iNOS、IL-6含量顯著降低(P<0.05)，IL-10含量顯著升高(P>0.05)。(表3)

表3 沉默MyD88表達對TNF-α誘導的心肌細胞IL-1β、iNOS、IL-6和IL-10水平的影響

2.7 沉默MyD88表達降低TNF-α誘導的心肌細胞NF-κB p-p65/p65水平Western blotting檢測各組細胞NF-κB p65磷酸化水平。結(jié)果顯示，與Control組相比，TNF-α組p-p65/p65比值顯著升高(P<0.05)；與TNF-α+shRNA-NC組相比，TNF-α+sh-MyD88組p-p65/p65比值顯著降低(P<0.05)。(圖4)

注：1. Control組；2. TNF-α組；3. TNF-α+shRNA-NC組；4. TNF-α+sh-MyD88組。與Control組相比，*P<0.05；與TNF-α+shRNA-NC組相比，#P<0.05。圖4 沉默MyD88表達對TNF-α誘導的心肌細胞p-p65/p65比值的影響

3 討論

MyD88作為TLR4的主要胞內(nèi)接頭蛋白，在TLR4激活引起的炎癥反應中發(fā)揮關鍵作用。TLR介導的心肌炎癥反應可使心肌遭受嚴重損傷[7]，故推測沉默MyD88表達可有效改善心肌炎癥。相關研究表明，MyD88敲除小鼠在腎臟和心肌缺血再灌注過程中能夠減少炎癥反應導致的組織損傷和功能紊亂[8]。同時，沉默MyD88可抑制IEC-6細胞凋亡，改善腸道炎癥性疾病[5]。本研究結(jié)果表明，TNF-α誘導炎癥性心肌細胞MyD88表達水平升高。

在心肌缺血再灌注損傷、心肌肥厚、動脈粥樣硬化等疾病發(fā)生過程中常常伴隨有炎癥反應。心肌細胞受到氧化應激刺激后，細胞分泌炎性因子，而過量的炎性因子可引起正常細胞的損傷，從而導致心功能障礙[9]。TNF-α是一種心肌炎癥損傷誘導因子，其可誘導正常心肌細胞凋亡，降低細胞增殖活性，誘導心肌炎癥損傷。IL-10是抑炎因子，可通過抑制NF-κB表達減少TNF-α等炎性因子的釋放，其表達量越高，組織炎癥性損傷情況越改善[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α處理后的H9C2心肌細胞IL-1β、iNOS、IL-6、IL-10水平升高，而沉默MyD88表達則逆轉(zhuǎn)促炎因子的釋放。

CK-MB、Mb、cTnⅠ是常見的心肌損傷標志物，在心肌損傷時會大量釋放，其含量高低用于評估心肌細胞的活力及狀態(tài)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默MyD88表達可降低TNF-α誘導的心肌細胞CK-MB、Mb、cTnⅠ水平，提示沉默MyD88表達可改善心肌損傷。

細胞凋亡也稱細胞程序性死亡，當心肌細胞發(fā)生炎癥反應時，細胞在基因水平上失去對其生長和凋亡的正常調(diào)控，凋亡程序發(fā)生紊亂，導致細胞異常凋亡[12]。細胞凋亡這一過程涉及凋亡誘導因子和凋亡抑制因子等調(diào)節(jié)因子。其中，抗細胞凋亡成員Bcl-2可防止細胞凋亡，而促凋亡成員Bax位于線粒體外膜或細胞質(zhì)，并在應激狀態(tài)下寡聚化，促進線粒體釋放促凋亡因子，從而引發(fā)細胞凋亡[13]。Bcl-2/Bax作為檢測細胞凋亡的常用指標，其比值增加意味著凋亡被抑制，這預示著損傷心肌可得到恢復。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默MyD88表達具有抑制TNF-α誘導的心肌細胞凋亡，升高Bcl-2 mRNA/BaxmRNA比值，提示沉默MyD88表達通過抑制細胞凋亡改善心肌損傷。

心肌炎時，心肌細胞的增殖活性會降低。Ki67是一種細胞增殖抗原，可作為細胞增殖活性評估的重要指標之一，目前在包括心肌細胞等的研究中被廣泛應用[14]。c-Myc是一種原癌基因，與細胞增殖周期有關，是細胞的轉(zhuǎn)錄促進因子，能促進細胞從G0/G1期進入S期[15]。當生長因子充足時，c-Myc對細胞的增殖分裂具有一定的促進作用，可有效抑制細胞凋亡；在生長因子不足的情況下，c-Myc則會抑制細胞分裂增殖及凋亡[16]。Cao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，艾塞那肽通過抑制TNF-α誘導的細胞凋亡保護心肌細胞。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默MyD88表達具有促進TNF-α誘導的心肌炎心肌細胞增殖，升高Ki67、c-MycmRNA水平的作用，提示沉默MyD88表達通過促進細胞增殖修復心肌損傷。

TLR/MyD88/NF-κB信號通路是機體炎癥體系中的重要通路，其廣泛存在于各種組織細胞中，在多種疾病發(fā)病及治療過程中發(fā)揮重要作用[18]。NF-κB是調(diào)控許多促炎基因表達的主要轉(zhuǎn)錄因子，在細胞炎癥進程中發(fā)揮重要作用[19]。NF-κB存在于細胞質(zhì)中，以異源二聚體的形式存在， 主要由p65和p50組成。TLR2、4可通過MyD88途徑將刺激信號轉(zhuǎn)導入細胞內(nèi)，產(chǎn)生級聯(lián)信號，導致NF-κB活化，從而啟動多種與炎癥反應相關的基因轉(zhuǎn)錄[20]。Xu等[21]研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB p65表達上調(diào)可誘導炎癥的發(fā)生，在心肌組織炎癥中表達上調(diào)。張紅利等[22]研究發(fā)現(xiàn)，參芍口服液通過抑制TLR4/MyD88依賴性信號通路抑制NF-κB的表達，繼而抑制炎癥級聯(lián)反應，從而達到保護心臟結(jié)構及功能的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默MyD88表達具有降低p-p65/p65比值的作用，提示其可通過抑制NF-κB p65磷酸化改善心肌細胞損傷。

綜上所述，沉默MyD88可促進TNF-α作用下心肌細胞增殖，抑制其凋亡并抑制炎性因子釋放。這可能是通過抑制NF-κB p65的活化實現(xiàn)的。本研究只在單一細胞株中進行初步研究，下一步計劃在原代心肌細胞及體內(nèi)進行多方面的驗證和分析。