陳翠蘭，尹富強(qiáng)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，是婦科病死率較高的惡性腫瘤之一[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),2020年美國卵巢癌新增病例約21 750例，新增死亡病例約13 940例[2]，我國每年新增病例約52 100例，死亡病例約22 500例[3]。卵巢癌臨床治療通常是手術(shù)切除后采用一線化療藥物鉑類和紫杉醇進(jìn)行化療，在初期通常能取得較好的效果。但隨著化療時(shí)間的延長，絕大多數(shù)卵巢癌患者會(huì)對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致患者死亡，這是卵巢癌治療失敗和生存率低下的主要原因。因此，探索和鑒定影響卵巢癌耐藥及預(yù)后的因子對(duì)于卵巢癌臨床化療方案的制定及臨床預(yù)后具有重要指導(dǎo)意義。lncRNA XIST是X染色體非活性特異性轉(zhuǎn)錄本長非編碼RNA[4]，已證明其在許多腫瘤中異常表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞增殖和分化，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及化療耐藥密切相關(guān)[5]，但目前其與卵巢癌耐藥及預(yù)后的相關(guān)研究仍較少。鑒此，本研究基于大數(shù)據(jù)挖掘分析和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，旨在探討其與卵巢癌化療耐藥和預(yù)后的關(guān)聯(lián)性，為進(jìn)一步深入研究其調(diào)控卵巢癌耐藥的機(jī)制和應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌敏感細(xì)胞HeyA8和SKOV3為課題組實(shí)驗(yàn)室保存。卡鉑耐藥細(xì)胞HeyA8-CBP(HeyA8卡鉑耐藥細(xì)胞)和SKOV3-CBP(SKOV3卡鉑耐藥細(xì)胞)及紫杉醇耐藥細(xì)胞HeyA8-R和SKOV3-R由課題組實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[6]。細(xì)胞培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清、100 units/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RIMP 1640完全培養(yǎng)基，于5% CO2，37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長情況以及狀態(tài)，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右時(shí)采用0.05%胰酶進(jìn)行消化傳代，3～4 d傳代一次。

1.2細(xì)胞總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用NanoDrop分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。隨后應(yīng)用cDNA第一鏈合成試劑盒(Takara,R407A)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃冰箱保存?zhèn)錂z，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測(cè) 應(yīng)用RT-qPCR檢測(cè)試劑盒(Takara,R820A)檢測(cè)細(xì)胞lncRNA XIST的表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參，所用引物序列見表1。檢測(cè)結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算分析。

表1 引物序列

1.4大數(shù)據(jù)挖掘和分析

1.4.1 卵巢癌組織和正常卵巢組織的lncRNA XIST表達(dá)水平比較分析 基于Oncomine數(shù)據(jù)庫[7](https://www.oncomine.org/resource/main.html)，選擇能檢測(cè)到lncRNA XIST表達(dá)的全部6組卵巢癌表達(dá)譜芯片，以P<0.01和fold>2為閾值，選擇漿液性(serous)卵巢癌樣本和正常卵巢組織樣本，最終納入3組芯片(Welsh表達(dá)譜芯片、Adib表達(dá)譜芯片、Bonome表達(dá)譜芯片)進(jìn)行比較分析。

1.4.2 lncRNA XIST與卵巢癌患者預(yù)后及耐藥的相關(guān)性分析 基于整合了15組來自GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫的獨(dú)立表達(dá)譜芯片(GSE23554、GSE63885、GSE3149、GSE15622、GSE14764、GSE27651、GSE65986、GSE51373、GSE18520、GSE26712、GSE9891、GSE19829、GSE26193、GSE30161和TCGA)，共包含1 815例卵巢癌樣本，采用Kaplan-Meier plotter和ROC plotter[8-9]分析lncRNA XIST表達(dá)與卵巢癌預(yù)后及耐藥的關(guān)聯(lián)性。在1 815例卵巢癌樣本中，不同的亞組所包括的樣本數(shù)不同，以實(shí)際分析納入的樣本數(shù)為準(zhǔn)。Kaplan-Meier plotter預(yù)后分析中，lncRNA XIST的高表達(dá)和低表達(dá)以數(shù)據(jù)庫自動(dòng)最佳閾值劃分；樣本選擇上不分層，包括了所有不同分期、分級(jí)、手術(shù)、化療的樣本，不限于某一亞組。ROC plotter耐藥相關(guān)性分析中，以化療后6個(gè)月是否復(fù)發(fā)作為敏感或耐藥的劃分依據(jù)[9]，無其他過濾和分層的限制?；熕幬锏姆纸M上，本研究納入了四組，即所有藥物(any drug)組、鉑類藥物(platin)組、紫杉醇(taxane)組及鉑類藥物+紫杉醇(platin+taxane)組。

2 結(jié)果

2.1卵巢癌組織和正常卵巢組織的lncRNA XIST表達(dá)水平比較 基于Oncomine數(shù)據(jù)庫的3個(gè)獨(dú)立卵巢癌表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示，與正常卵巢組織相比，卵巢癌組織的lncRNA XIST表達(dá)水平下調(diào)2倍以上。與正常卵巢組織比較，在Welsh表達(dá)譜芯片中卵巢癌組織的lncRNA XIST表達(dá)水平下調(diào)10.653倍(t=5.545,P=0.000)，在Adib表達(dá)譜芯片中下調(diào)2.041倍(t=3.147,P=0.008)，在Bonome表達(dá)譜芯片中下調(diào)2.565倍(t=7.055,P=0.000)。見圖1。

圖1 三組獨(dú)立卵巢癌表達(dá)譜芯片(Welsh、Adib及Bonome)中卵巢癌組織和正常卵巢組織的lncRNA XIST表達(dá)水平比較圖

2.2卵巢癌lncRNA XIST表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 通過Kaplan-Meier plotter分析卵巢癌lncRNA XIST表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果顯示，與lncRNA XIST高表達(dá)組相比，lncRNA XIST低表達(dá)組在總生存期(overall survival，OS)、無進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)和進(jìn)展后生存期(post-progression survival，PPS)方面的預(yù)后更差(P<0.05)。見圖2。

圖2 Kaplan-Meier plotter分析結(jié)果圖

2.3卵巢癌敏感細(xì)胞與耐藥細(xì)胞的lncRNA XIST表達(dá)水平比較 RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與卵巢癌親本細(xì)胞HeyA8及SKOV3相比，lncRNA XIST在紫杉醇耐藥細(xì)胞HeyA8-R和SKOV3-R及卡鉑耐藥細(xì)胞HeyA8-CBP和SKOV3-CBP中均顯著下調(diào)(下調(diào)倍數(shù)>26，P<0.001)。見圖3。

H：HeyA8細(xì)胞；H-R：紫杉醇耐藥細(xì)胞HeyA8-R；H-C：卡鉑耐藥細(xì)胞HeyA8-CBP；S：SKOV3細(xì)胞；S-R：紫杉醇耐藥細(xì)胞SKOV3-R；S-C：卡鉑耐藥細(xì)胞SKOV3-CBP。H vs H-R(t=131.065,P=0.000)，H vs H-C(t=163.410，P=0.000)，S vs S-R(t=30.475，P=0.000)和S vs S-C(t=26.907，P=0.000)

2.4lncRNA XIST預(yù)警卵巢癌化療耐藥分析結(jié)果 基于GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析比較lncRNA XIST在卵巢癌耐藥組織(non-responder)和敏感組織(responder)中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在對(duì)所有藥物、鉑類藥物、紫杉醇以及鉑類藥物+紫杉醇4個(gè)分組中，耐藥組織的lncRNA XIST表達(dá)水平均顯著低于敏感組織(P<0.05)。ROC plotter分析結(jié)果顯示，對(duì)于所有藥物耐藥，lncRNA XIST的預(yù)警截?cái)嘀禐? 977；對(duì)于鉑類藥物耐藥，lncRNA XIST的預(yù)警截?cái)嘀禐? 977；對(duì)于紫杉醇耐藥，lncRNA XIST的預(yù)警截?cái)嘀禐? 245；對(duì)于鉑類藥物+紫杉醇耐藥，lncRNA XIST的預(yù)警截?cái)嘀禐? 245。見圖4。

圖4 lncRNA XIST預(yù)警卵巢癌化療耐藥分析結(jié)果圖

3 討論

3.1lncRNA是一類長度>200 bp的非編碼RNA，具有豐度高、物種保守性低、組織表達(dá)特異和作用方式多樣等特點(diǎn)，被認(rèn)為是生命活動(dòng)中的重要調(diào)控因子，可通過直接或間接作用于靶基因、調(diào)節(jié)組蛋白進(jìn)行修飾和染色質(zhì)重塑，也可作為內(nèi)源競(jìng)爭性RNA等方式發(fā)揮作用[10]。進(jìn)而通過調(diào)控藥物外排、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)藥物靶標(biāo)突變等過程調(diào)節(jié)腫瘤耐藥并影響患者預(yù)后[11]。如lncRNA GAS5[12-13]、lncRNA TP73-AS1[14]、lncRNA CCAT1和lncRNA MALAT1[15]等，均已證明在卵巢癌進(jìn)展及耐藥調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，并對(duì)卵巢癌患者預(yù)后產(chǎn)生影響。lncRNA GAS5是細(xì)胞凋亡和生長抑制的關(guān)鍵因子，通常作為分子誘餌阻止糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)和糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(glucocorticoid response element，GRE)結(jié)合，調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞周期和凋亡[12]。lncRNA TP73-AS1能夠通過影響Zeste基因增強(qiáng)子同源物基因2(enhancer of Zeste homolog 2,EZH2)和組蛋白第27位氨基酸甲基化(H3K27me3)與P21啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合，沉默P21基因的表達(dá)，促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移侵襲能力，抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而調(diào)控上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)的進(jìn)展[16]。lncRNA CCAT1能夠靶向多個(gè)mircoRNA，通過CCAT1-miR-152/miR-130b/ADAM17/Wnt1/STAT1/ZEB1軸和CCAT1/miR-490-3p/TGFβR1軸對(duì)卵巢癌發(fā)揮調(diào)控作用[17]。lncRNA MALAT1在卵巢癌中上調(diào)表達(dá)可使PHF19沉默進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，通過靶向mircoRNA-211來阻滯細(xì)胞周期增加細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制卵巢腫瘤細(xì)胞生長遷移，參與卵巢癌調(diào)控[18]。

3.2本研究結(jié)果顯示，lncRNA XIST與腫瘤進(jìn)展及預(yù)后具有顯著關(guān)聯(lián)。Kobayashi等[19]研究顯示，lncRNA XIST的表達(dá)與接受鉑類藥物放化療的宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的OS相關(guān)，lncRNA XIST高表達(dá)預(yù)示更好的OS。在卵巢癌中，與卵巢上皮細(xì)胞相比，lncRNA XIST在50%的卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)缺失[20],而其上調(diào)表達(dá)具有顯著的抗腫瘤活性，可能通過吸附miR-214-3p而發(fā)揮作用[21]。本研究通過表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)的挖掘與分析，結(jié)果顯示lncRNA XIST在卵巢癌組織中顯著下調(diào)表達(dá)，且lncRNA XIST低表達(dá)與卵巢癌患者不良預(yù)后顯著相關(guān)，提示卵巢癌lncRNA XIST低表達(dá)有作為預(yù)后標(biāo)志物應(yīng)用于臨床的潛在價(jià)值。

3.3另外，本研究結(jié)果顯示lncRNA XIST與腫瘤耐藥相關(guān)。在直腸癌中，與高表達(dá)組相比，lncRNA XIST低表達(dá)組患者對(duì)5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)化療的耐藥率更高[22]，提示lncRNA XIST低表達(dá)可能與腫瘤耐藥調(diào)控相關(guān)。而與原發(fā)性卵巢癌相比，lncRNA XIST在復(fù)發(fā)性腫瘤中下調(diào)至少6.7倍以上，lncRNA XIST低表達(dá)與紫杉醇耐藥正相關(guān)[23]。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示，lncRNA XIST在紫杉醇耐藥細(xì)胞HeyA8-R和SKOV3-R及卡鉑耐藥細(xì)胞HeyA8-CBP和SKOV3-CBP中均顯著下調(diào)，且基于卵巢癌的數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明，lncRNA XIST在卵巢癌耐藥組織中顯著下調(diào)，且具有預(yù)警卵巢癌對(duì)鉑類、紫杉醇以及其他藥物耐藥發(fā)生的價(jià)值，對(duì)臨床治療用藥具有一定的指導(dǎo)價(jià)值。但值得注意的是，也有研究[24]表明，敲低lncRNA XIST表達(dá)能夠通過抑制細(xì)胞自噬來增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，從而抑制細(xì)胞耐藥。上述兩種不同結(jié)論可能與不同的腫瘤類型有關(guān)，在不同的腫瘤中，lncRNA XIST扮演著癌基因或抑癌基因的不同角色[4]。

綜上所述，lncRNA XIST在卵巢癌卡鉑/紫杉醇耐藥細(xì)胞、耐藥卵巢癌組織及卵巢癌組織中均顯著下調(diào)，且其低表達(dá)具有預(yù)警鉑類和紫杉醇等化療藥物的耐藥，并與卵巢癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，具有較好的臨床潛在應(yīng)用價(jià)值。