張敏鴻，曾 勇，盧洪飛

血管瘤是嬰幼兒時期較為常見的內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖所致的一種良性腫瘤，發(fā)病率為4%～5%，其發(fā)病機(jī)制尚未明晰[1]。大多數(shù)血管瘤病變可自然消退，但部分患者瘤體生長在關(guān)鍵部位，導(dǎo)致潰瘍、毀容或器官功能損害，甚至危及生命[2]。目前，雖然普萘洛爾已成為血管瘤治療的臨床一線藥物，但仍存在部分患者對普萘洛爾耐藥以及復(fù)發(fā)等情況，增加了治療難度。因此，研究血管瘤進(jìn)展過程中的相關(guān)信號通路，可為血管瘤分子靶向藥物研發(fā)提供新的思路。血管的生成及發(fā)生受細(xì)胞信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的精密調(diào)節(jié)，血管瘤的發(fā)生發(fā)展與多條信號通路異常、失活密切相關(guān)，包括血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)/血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)信號通路、Notch信號通路、Ang-Tie信號通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,Ras)信號通路等[3-4]。Sonic Hedgehog是一條調(diào)控分泌信號蛋白、進(jìn)化高度保守的信號通路[5]，其在控制胚胎發(fā)育和成體組織穩(wěn)態(tài)中至關(guān)重要，對包括細(xì)胞增殖、凋亡在內(nèi)的幾乎所有細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)起到關(guān)鍵作用[6]。Sonic Hedgehog信號通路在血管生成及發(fā)生中發(fā)揮重要作用，在胰腺癌、肝癌、動脈粥樣硬化、缺血性心臟病等病理?xiàng)l件下可見其異常表達(dá)[7-10]。本研究旨在分析Sonic Hedgehog信號通路對小鼠血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(mouse hemangioma endothelial cells,EOMA細(xì)胞)增殖的影響，以探討Sonic Hedgehog信號通路對血管瘤發(fā)生發(fā)展的作用及其可能的分子機(jī)制，為血管瘤的治療和診斷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，F(xiàn)orma 311)、潔凈工作臺(SW-CJ-2FD，上海博迅)、熒光定量PCR儀(Bio-Rad,CFX3.1)、流式細(xì)胞儀(BD,FACSCalibur)、連續(xù)光譜多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher,Varioskan Flash)、超純水儀(Millipore,RiOs5+Milli-Q Biocel)、萬向脫色搖床(北京六一，WD-9405B)等。

1.2實(shí)驗(yàn)材料與試劑 EOMA細(xì)胞系(由贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心保藏并提供)；高糖Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM)培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購于美國Gibco公司；噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)粉劑購于美國Sigma公司；EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒、Sonic Hedgehog信號通路抑制劑GANT61、Sonic Hedgehog信號通路激動劑SAG等購于上海碧云天公司。所有化學(xué)試劑均達(dá)分析純。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 使用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)EOMA細(xì)胞。細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時以0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，傳代，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4MTT比色法檢測細(xì)胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種2×103個EOMA細(xì)胞于96孔板，最終工作體積為200 μl。設(shè)調(diào)零組、對照組、實(shí)驗(yàn)組，各孔均重復(fù)3次。EOMA細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，加入不同濃度的GANT61及二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，GANT61工作濃度分別為10、20、40、80、160 μmol/L，DMSO含量不高于0.1%。培養(yǎng)24、48、72 h后，加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，吸棄上清，每孔加入150 μl DMSO。酶標(biāo)儀測量各孔490 nm波長處的光密度OD吸光值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/(對照組OD值-調(diào)零組OD值)×100%。應(yīng)用GraphPad Prism 6.0軟件計(jì)算GANT61作用EOMA細(xì)胞24 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)，選擇合適濃度范圍用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5EdU染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長細(xì)胞，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種2×105個EOMA細(xì)胞于6孔板，細(xì)胞培養(yǎng)過夜。加入20、40、80 μmol/L濃度的GANT61及DMSO，藥物處理24 h。培養(yǎng)基更換為1 ml 10 μM EdU培養(yǎng)基，孵育2 h，0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，加入1 ml 4%多聚甲醛固定15 min后，1 000 r/min離心5 min棄上清。加入2 ml 2 mg/ml甘氨酸中和5 min，1 000 r/min離心5 min棄上清。2 ml磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)清洗1次，加入0.5% TritonX-100滲透劑室溫孵育10 min，2 ml PBS清洗1次。加入200 μl Apollo染色反應(yīng)液，避光孵育10 min，1 000 r/min離心5 min棄上清，加入3 ml 0.5% TritonX-100滲透劑清洗1次，1 000 r/min離心5 min棄上清，500 μl PBS重懸細(xì)胞，流式上機(jī)檢測。EdU陽性細(xì)胞群為增殖細(xì)胞，細(xì)胞增殖抑制率即為EdU陽性細(xì)胞占比。

1.6實(shí)時熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法檢測細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表達(dá) 提取20、40、80 μmol/L濃度GANT61及0.5 μmol/L濃度SAG處理24 h后的細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行RT-qPCR檢測，所用引物及其序列見表1。以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

表1 引物名稱及序列

2 結(jié)果

2.1不同時間處理組不同GANT61濃度EOMA細(xì)胞增殖抑制率比較 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GANT61處理濃度越大、作用時間越長，EOMA細(xì)胞的增殖抑制率越大，呈劑量及時間依賴性(P<0.05)。當(dāng)處理24 h時，IC50值為79.42 μmol/L，選擇20、40、80 μmol/L藥物濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表2。

表2 不同時間處理組不同GANT61濃度EOMA細(xì)胞增殖抑制率比較

2.2不同處理組EOMA細(xì)胞增殖率比較 EdU染色流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，隨著GANT61藥物濃度的增加，EOMA細(xì)胞增殖抑制率越大，呈計(jì)量依賴性(F=47.057,P=0.000)。0.5 μmol/L SAG干預(yù)處理可促進(jìn)細(xì)胞增殖，與對照組[GANT61(-)，SAG(-)]比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.819,P=0.004)。見圖1。

圖1 不同處理組EOMA細(xì)胞增殖率比較圖

2.3不同處理組Cyclin D1、PCNA表達(dá)水平比較 RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，Cyclin D1和PCNA的mRNA表達(dá)水平均隨GANT61干預(yù)濃度的增加而降低，差異顯著(F=15.788,P=0.004;F=19.324,P=0.002)。見圖2?。與對照組比較，SAG干預(yù)處理可提高Cyclin D1和PCNA的mRNA表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.250,P=0.035;t=2.978,P=0.041)。見圖2?。

?GANT61處理組；?SAG處理組

3 討論

3.1Sonic Hedgehog信號通路是一條進(jìn)化高度保守的信號通路，其不僅能有效調(diào)控哺乳動物胚胎發(fā)育過程，而且在調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、血管生成等方面起重要作用。在正常生理或病理?xiàng)l件下，Sonic Hedgehog信號通路在血管生成中發(fā)揮重要作用。研究表明[11]Sonic Hedgehog信號通路參與調(diào)控腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移：在肝細(xì)胞癌中Sonic Hedgehog抑制劑Vismodegib/GDC-0449可阻斷肝癌細(xì)胞中VEGF的產(chǎn)生，導(dǎo)致血管密度下降，血管生長減少，抑制腫瘤生長。Hong等[12]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌中Sonic Hedgehog信號通路核轉(zhuǎn)錄因子Gli1激活Sonic Hedgehog信號通路促進(jìn)結(jié)直腸癌中淋巴管生成蛋白、VEGF-C和VEGFR3表達(dá)。另外，Huaitong等[13]研究發(fā)現(xiàn)口腔癌細(xì)胞釋放的微泡通過Shh信號通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成。目前，許多學(xué)者致力于靶向Sonic Hedgehog信號通路關(guān)鍵組分研究開發(fā)抗腫瘤藥物[14]，已有兩種抑制劑LDE225/Sonidegib和GDC-0449/Vismodegib獲得美國食品藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)，用于治療基底細(xì)胞癌[15]，同時大量靶向Sonic Hedgehog信號通路的抗腫瘤藥物也處于臨床試驗(yàn)中?；赟onic Hedgehog信號通路對腫瘤血管生成的調(diào)控作用，通過靶向Sonic Hedgehog信號抑制血管生成或許可為抗血管生成提供理論依據(jù)。

3.2血管瘤是嬰幼兒時期最常見的良性軟組織實(shí)體腫瘤，盡管大多數(shù)血管瘤為可自行消退的自限性疾病，但其呈浸潤性生長，破壞周圍組織，且部分患者由于腫瘤處于快速增生期或位于重要部位，可導(dǎo)致瘤體破潰、出血、功能損害等嚴(yán)重并發(fā)癥，引起生理功能障礙，甚至危及生命，所以血管瘤在一些情況下又具有部分惡性腫瘤進(jìn)程的特點(diǎn)[16]。目前，有關(guān)血管瘤的發(fā)病機(jī)制并不明晰，進(jìn)一步深入研究血管瘤自行消退機(jī)制，對血管瘤的早期診斷及治療具有重要意義。近年國內(nèi)外研究[17-18]發(fā)現(xiàn)在增殖期血管瘤中可見Sonic Hedgehog信號通路配體蛋白Shh、轉(zhuǎn)錄因子Gli2及其靶基因FOXA2表達(dá)上調(diào)，Sonic Hedgehog信號通路異常激活，但Sonic Hedgehog信號通路在調(diào)控血管瘤進(jìn)展中的作用機(jī)制及調(diào)控Sonic Hedgehog信號通路對血管瘤細(xì)胞生物學(xué)功能作用的文獻(xiàn)報(bào)道較少。

3.3EOMA細(xì)胞是小鼠血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，為血管瘤研究常用細(xì)胞模型。本研究結(jié)果顯示Sonic Hedgehog信號通路抑制劑GANT61可抑制EOMA細(xì)胞增殖，且呈時間及劑量依賴性，而Sonic Hedgehog信號通路激活劑SAG可促進(jìn)EOMA細(xì)胞增殖。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，經(jīng)GANT61干預(yù)作用后，EOMA細(xì)胞的增殖相關(guān)基因PCNA及Cyclin D1表達(dá)下調(diào)，且呈劑量依賴，而SAG干預(yù)可上調(diào)PCNA及Cyclin D1的表達(dá)。表明Sonic Hedgehog信號通路在EOMA細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，特異性抑制該信號通路可抑制EOMA細(xì)胞增殖，這與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果相似，其機(jī)制可能為Sonic Hedgehog信號通路通過調(diào)控PCNA及Cyclin D1參與細(xì)胞增殖，但是否通過調(diào)控血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖來調(diào)節(jié)血管生成具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，調(diào)控Sonic Hedgehog信號通路活性可影響血管瘤細(xì)胞增殖，提示Sonic Hedgehog信號通路可能參與了血管瘤的發(fā)生發(fā)展過程，這可能為血管瘤的診治方法提供了新的思路方向。但本研究未能在臨床組織樣本中檢測血管瘤患者中Sonic Hedgehog信號通路其他關(guān)鍵組分的表達(dá)情況，也未涉及動物水平的體內(nèi)研究，研究結(jié)論及具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。