周倩倩，唐 穎

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病的常見并發(fā)癥，也是中老年人視力喪失的主要原因之一[1]。炎癥是DR的關鍵病理過程，鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導的糖尿病大鼠發(fā)病早期即可在視網(wǎng)膜血管中檢測到白細胞黏附增加導致淤積，并且與內(nèi)皮損傷和血-視網(wǎng)膜屏障的破壞相關[2]。當DR進展到新生血管形成時，稱為增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)。研究[3]證實血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在介導新生血管方面扮演重要角色，抗VEGF藥物的出現(xiàn)徹底改變了PDR的治療方式，已經(jīng)成為多種新生血管性眼病的一線用藥。然而，抗VEGF藥物較短的半衰期需要每月注射以確保治療效果，給患者帶來了沉重的經(jīng)濟負擔和精神壓力，這也凸顯了尋找不同治療靶點的重要性[4]?；|(zhì)細胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF-1)是一種具有趨化活性的細胞因子，由骨髓基質(zhì)細胞合成，與趨化因子受體4(chemokine receptor 4,CXCR-4)結(jié)合可促進形成新生血管。此前的研究主要集中在DR患者的玻璃體SDF-1濃度與病變程度的關聯(lián)性，抑制SDF-1對DR的進展是否存在抑制作用仍有待進一步證實。丹皮酚又稱牡丹酚，是毛茛科植物牡丹根皮的提取物，在心血管系統(tǒng)中已有較深入的研究，對急性炎癥反應有抑制作用[5]，但其對DR作用的研究較少。鑒此，本研究旨在觀察丹皮酚對STZ誘導的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜SDF-1和VEGF表達的影響，初步探討丹皮酚發(fā)揮DR治療作用的可能機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 選擇7～8周齡，體重180～200 g雄性健康美國斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠36只，均由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。隨機分為正常對照組(CON組)、丹皮酚組(DPF組)和糖尿病組(DM組)，每組12只。按干預時長不同，各組又再分為1月組、3月組和5月組，每組4只。

1.2動物模型構(gòu)建 SD大鼠于無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級實驗動物房飼養(yǎng)，禁食12 h。DM組糖尿病大鼠模型的制備：用新鮮配置的檸檬酸鹽緩沖液(濃度1%，pH4.3)稀釋STZ(北京博愛港公司)，按65 mg/kg一次性腹腔注射，誘導建立糖尿病大鼠模型。若大鼠餐后2 h血糖<16.7 mmol/L則再重復注射STZ一次，劑量為10 mg/kg。再次注射后第3天測餐后血糖，以兩次餐后2 h血糖濃度>16.7 mmol/L定義為糖尿病大鼠模型構(gòu)建成功。CON組大鼠以等體積檸檬酸鹽緩沖液一次性腹腔內(nèi)注射，7 d后測餐后血糖值，以餐后2 h血糖值<16.7 mmol/L確定納入CON組。血糖監(jiān)測均通過尾靜脈采血，測前尾部碘伏棉簽消毒，測后涂擦金霉素眼膏，儀器為美國強生OneTouch SureStep血糖儀。

1.3干預方法 (1)DPF組：糖尿病模型建立成功3 d后，每周按4.32 mg/kg予丹皮酚顆粒(三九藥業(yè))溶解液3 ml灌胃。(2)DM組：糖尿病模型建立成功3 d后，第3天始每周予生理鹽水3 ml灌胃。(3)CON組：在相應時點每周予生理鹽水3 ml灌胃。藥物干預后立即予以充分的水和食物，普通大鼠飼料喂養(yǎng)。每日定時更換墊料保持鼠籠內(nèi)干燥，預防感染。定期檢查大鼠體重、毛色、飲食和尿量等情況。飼養(yǎng)過程中各組均無大鼠死亡。

1.4樣本采集和保存 各組大鼠到干預期限后，禁食12 h測量血糖，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛后處死老鼠取出眼球。于鋸齒緣后0.5 mm處剪開眼球壁，去除眼前節(jié)和玻璃體。將剩余鞏膜和視網(wǎng)膜組織浸入2.5%戊二醛溶液固定1周。將眼球壁以視乳頭為中心切4塊，在顯微鏡(Nikon-SMZ1500，日本)下剝離出視網(wǎng)膜，用鋒利刀片迅速切取橫切面約1 mm2的長條形小塊標本，于上方12點方位角鞏膜緣縫線標記，置于4%多聚甲醛固定液中固定24 h，用于石蠟切片。

1.5蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色法 將石蠟切片置于二甲苯(Ⅰ)15 min，二甲苯(Ⅱ)中15 min脫蠟。梯度酒精脫蠟至水：100%酒精10 min，95%酒精10 min，85%酒精10 min，70%酒精10 min，蒸餾水沖洗10 min。蘇木素染液染色2～3 min，水洗玻片多余染液。1%鹽酸酒精分色片刻，鏡檢控制直至細胞核及核內(nèi)染色質(zhì)清晰，約數(shù)十秒鐘，自來水沖洗。蒸餾水洗后入伊紅染液染色2 min，自來水沖洗。梯度酒精脫水：切片入70%酒精3 min，85%酒精3 min，95%酒精3 min，100%酒精3 min。置于二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)中透明各1 min。擦去切片多余二甲苯，滴加中性樹膠，再加蓋玻片封固。高倍鏡(×20，Nikon-SMZ1500，日本)下觀察三組視網(wǎng)膜切片中的細胞核，隨機計數(shù)5個不同區(qū)域的突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)的均值，玻璃體腔內(nèi)其他與內(nèi)界膜無關系的血管內(nèi)皮細胞核不包括在內(nèi)。

1.6SDF-1和VEGF檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法檢測SDF-1和VEGF的mRNA表達。使用RNA提取試劑盒(EZ-press RNA Purification Kit,美國EZBioscience公司)抽提細胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA用于后續(xù)反應，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國EZBioscience公司。根據(jù)美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫的資料信息進行SDF-1、VEGF和18S(內(nèi)參)引物設計，序列見表1，由生工生物工程股份有限公司合成。以每組3個復孔，重復3次進行實時定量PCR檢測。以2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析處理。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1三組大鼠處死前各時點餐后2 h血糖水平比較 在經(jīng)不同干預時長后，DM組和DPF組處死前的餐后2 h血糖水平均顯著高于CON組(P<0.05)，但DM組與DPF組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。提示糖尿病大鼠模型建立成功。見表2。

表2 三組大鼠處死前各時點餐后2 h血糖水平比較

2.2三組大鼠各時間點視網(wǎng)膜突破內(nèi)界膜的細胞核數(shù)比較 DM組和DPF組大鼠視網(wǎng)膜突破內(nèi)界膜的細胞核數(shù)均較CON組顯著增加(P<0.05)。DM組和DPF組的視網(wǎng)膜突破內(nèi)界膜的細胞核數(shù)隨干預時間的延長而增加，且DPF組各時間點的細胞核數(shù)均顯著少于DM組(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 三組大鼠各時間點視網(wǎng)膜突破內(nèi)界膜的細胞核數(shù)比較個/視野]

圖1 干預5月時各組視網(wǎng)膜突破內(nèi)界膜HE染色圖片(×20)

2.3三組大鼠各時間點視網(wǎng)膜SDF-1、VEGF mRNA表達水平比較 在干預1個月、3個月和5個月時間點，DM組SDF-1 mRNA和VEGF mRNA的表達水平均顯著高于CON組和DPF組(P<0.05)，DPF組表達水平稍高于CON組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

?SDF-1 mRNA相對表達水平；?VEGF mRNA相對表達水平；*表示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)

3 討論

3.1DR是一種微血管異常的病變，內(nèi)皮細胞核會突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜移行到缺血缺氧部位產(chǎn)生新的毛細血管。本研究中HE染色發(fā)現(xiàn)DM組大鼠視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮細胞的細胞核突破內(nèi)界膜數(shù)量較多，而DPF組數(shù)量盡管高于CON組，但較DM組有所降低，說明丹皮酚對于內(nèi)皮細胞核的移行起到一定的抑制作用。

3.2丹皮酚是丹皮的提取物，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、解熱和抑制變態(tài)反應的作用，是一種藥理活性廣泛、高效低毒的藥物[5]。孫國平等[6]研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚在體外有細胞毒性作用，灌胃給藥有抗腫瘤作用。楊驊等[7]研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚具有血管內(nèi)皮保護作用，可以預防物理造成的血管內(nèi)皮損傷。朱作金等[8]發(fā)現(xiàn)丹皮酚霧化吸入可以提高大鼠肺局部非特異性免疫功能。但關于丹皮酚對視網(wǎng)膜血管的作用機制的研究較少。本研究RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，DPF組SDF-1、VEGF mRNA表達水平低于DM組，介于DM組與CON組之間，提示丹皮酚可以一定程度上抑制VEGF和SDF-1的表達。

3.3SDF-1是由骨髓基質(zhì)細胞合成、具有趨化活性的細胞因子，能夠促進血管的生成。CXCR-4分屬于G蛋白耦聯(lián)化學因子受體，且是SDF-1的惟一受體。SDF-1與CXCR-4結(jié)合形成SDF-1/CXCR-4生物軸，表達于血小板及內(nèi)皮細胞，誘導新生血管的生成。SDF-1與CXCR-4特異性結(jié)合后，參與介導炎癥反應、造血干細胞(hematopoietic stem cell，HSC)遷移及歸巢[9]。有研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，通過皮下注射SDF-1/CXCR-4軸阻斷劑，可以導致細胞因子失去歸巢能力，組織修復功能降低，繼而阻礙新生血管的生成。另外，有研究[12]顯示SDF-1α能夠顯著刺激VEGF和CXCR-4在骨髓來源間充質(zhì)干細胞的表達，而外周血中存在的CD34+細胞來源于骨髓，其是具有與HSC大量相同表面抗原的細胞群，在體內(nèi)可被缺血動員，并移行至缺血組織，參與新生血管的生成。SDF-1的調(diào)節(jié)可改善糖尿病患者急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)后的心臟修復，這提示SDF-1、CXCR-4在新生血管形成過程中具有其他細胞因子難以比擬的重要作用。

3.4研究[13]表明，SDF-1和DR關系密切，玻璃體中SDF-1的集聚與視網(wǎng)膜病變、黃斑水腫程度有直接的關系。SDF-1/CXCR-4途徑可能通過增加細胞活力來改善DR[14-15]。也有研究[16-17]發(fā)現(xiàn),PDR患者玻璃體內(nèi)VEGF與SDF-1的表達與非PDR患者相比均有明顯升高,而有糖尿病黃斑水腫的患者玻璃體SDF-1濃度更高。而實驗研究[17]表明，在阻斷VEGF作用后，單獨SDF-1眼內(nèi)注射可造成DR，且即使存在外源性VEGF，玻璃體內(nèi)注射針對SDF-1的封閉抗體也可以防止視網(wǎng)膜新生血管形成。本研究發(fā)現(xiàn)，DM組大鼠視網(wǎng)膜中SDF-1、VEGF mRNA表達水平高于DPF組和CON組，且干預時間越長，表達水平差異越顯著，與相關研究[18-19]結(jié)論相符。表明丹皮酚能夠抑制SDF-1的表達，通過SDF-1/CXCR-4軸及一系列信號通路，抑制VEGF的表達，減少新生血管的生成，對于DR的發(fā)生、發(fā)展能夠起到一定的抑制作用。

綜上所述，丹皮酚可以通過下調(diào)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中SDF-1和VEGF的表達來抑制視網(wǎng)膜新生血管形成，且作用時間較為持久，對DR的發(fā)生、發(fā)展具有抑制作用。