陸觀珠 包玉潔 白玉盤 焉雷 許潔

肝移植是治療終末期肝病的有效方法，但是由于供肝缺乏，治療費用昂貴，且患者需要終生服用抗免疫排斥藥物，臨床應(yīng)用受到限制，因此尋求和探索一種新的肝硬化治療技術(shù)成為臨床與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的重要研究熱點之一。人乳牙牙髓干細胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)具有易獲得，低免疫原性和高分化潛能的優(yōu)點。本研究通過建立小鼠肝硬化模型及SHED治療肝硬化模型，檢測小鼠肝功能、體重、肝臟濕重以及肝臟組織病理學(xué)表現(xiàn)，在動物體內(nèi)初步驗證SHED對延緩或逆轉(zhuǎn)肝硬化/肝纖維化的安全性及有效性。

材料與方法

一、實驗材料

BABL/c小鼠，雄性，6周齡，體質(zhì)量為(16±1)g，SPF級。實驗涉及的所有動物處理內(nèi)容均遵從實驗動物實驗管理和動物福利相關(guān)條例和法規(guī)，實驗設(shè)計經(jīng)過倫理委員會批準(zhǔn)并由其監(jiān)督支持。

實驗用SHED在GMP條件下培養(yǎng)，細胞采用0.9% NaCl溶液進行重懸，由卡替(上海)生物技術(shù)有限公司提供。

二、小鼠肝硬化模型及干細胞治療模型建立

15只小鼠飼養(yǎng)于沒有病原菌的環(huán)境下，在整個實驗過程中有充足的水分和食物。將15只小鼠隨機分為A、B、C組，每組5只。肝硬化模型的建立：將A組和B組小鼠腹腔注射10% CCl4(4 μL/g)，2次/周，C組腹腔注射0.9% NaCl溶液(4 μL/g)，2次/周。每2周稱量記錄小鼠體重1次。在肝硬化模型建立的第4周，A組和C組小鼠予尾靜脈注射0.9% NaCl 200 μL，1周1次；同時將1×106SHED懸浮于200 μL 0.9% NaCl溶液中，混勻，經(jīng)尾靜脈注射入B組小鼠，每周注射1次，共4周。在第9周時行乙醚麻醉，各組隨機取3只小鼠眼眶取血，離心分離血清，應(yīng)用小鼠肝功能試劑盒檢測肝功能指標(biāo)。安樂處死小鼠，所有小鼠各取1 cm×1 cm的肝臟組織，4%甲醛固定，進行組織病理學(xué)檢查。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、造模9周后3組小鼠肝功能比較

結(jié)果顯示：A組和B組小鼠的肝功能各項指標(biāo)均較C組小鼠顯著增高。進一步比較B組與A組的肝功能情況，發(fā)現(xiàn)B組肝硬化小鼠的肝功能指標(biāo)均較A組有顯著的好轉(zhuǎn)(表1)。由此可見，經(jīng)尾靜脈注射SHED能夠明顯改善肝硬化小鼠的肝功能，對肝細胞具有一定的修復(fù)作用。

表1 3組小鼠造模9周后的生化指標(biāo)比較(±s)

二、3組小鼠體質(zhì)量和肝臟濕重比較

記錄3組小鼠的生長曲線發(fā)現(xiàn)：A組和B組小鼠的體質(zhì)量增長較C組小鼠嚴(yán)重滯后(P<0.01)，而B組小鼠較A組的體質(zhì)量增長有所恢復(fù)(P<0.01)。第9周處死各組小鼠后，解剖肝臟，肉眼可見C組小鼠的肝臟色澤紅潤，表面光滑，肝葉邊緣銳利，質(zhì)地柔軟。經(jīng)CCl4造模的小鼠肝臟色澤晦暗，表面粗糙，可見大小不等結(jié)節(jié)，肝葉邊緣粗鈍，提示CCl4腹腔注射4周成功建立肝硬化模型。處死時各組小鼠的體重和肝臟濕重均有顯著差異：A組的小鼠體質(zhì)量(22.86±0.97)g及肝臟濕重 (1.88±0.148)g低于C組的小鼠體質(zhì)量(27.54±1.71)g及肝臟濕重(2.38±0.13)g，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.661、5329，均P<0.01)；而B組的小鼠體質(zhì)量 (25.80±1.02)g及肝臟濕重 (2.16±0.114)g較A組顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.347、4.668，P<0.01)。

三、3組小鼠肝組織光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)

第9周處死小鼠后解剖肝臟組織顯示，C組小鼠肝臟切片HE染色可見肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝竇無擴張，肝細胞索規(guī)則，肝細胞形態(tài)正常(圖1A)；A組小鼠的肝臟失去肝小葉正常結(jié)構(gòu)，有多個大小不等的假小葉形成，肝竇擴張，肝細胞索排列紊亂，部分細胞變性、壞死，可見較多炎性細胞浸潤(圖1B)；B組小鼠肝臟病理可見假小葉數(shù)量較A組減少，肝細胞排列紊亂明顯好轉(zhuǎn)，組織結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，且肝細胞變性、壞死有所減輕，炎癥細胞浸潤明顯減少(圖1C)。由此可見，SHED可部分緩解肝硬化小鼠的肝臟纖維化程度，同時減輕匯管區(qū)的炎癥反應(yīng)。

A.C組小鼠肝臟；B.A組小鼠的肝臟病理學(xué)表現(xiàn)；C.B組小鼠的肝臟病理學(xué)表現(xiàn)圖1 3組小鼠肝組織光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)(HE，低倍放大)

討 論

既往基礎(chǔ)研究與臨床試驗已證實，間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)能夠有效治療肝硬化[1]。健康雄性大鼠MSC可以植入肝臟匯管區(qū)、肝細胞索，植入細胞最早見于移植后約7 d，植入的MSC能夠部分代替肝細胞的功能。張衛(wèi)光等[2]將人胚胎臍帶血分離的MSC植入肝硬化的大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)移植大鼠的體質(zhì)量明顯增加，肝纖維化的程度顯著減輕。

牙髓是牙體組織的一部分，含有結(jié)締組織、間充質(zhì)細胞、神經(jīng)纖維、血管和淋巴等。人牙髓干細胞(human dental pulp stem cells，hDPSC)是一類存在于人牙髓組織(乳牙、恒牙)中具有較強的自我更新和多向分化潛能的間充質(zhì)干細胞[3]。Gronthos等[4]收集了19～29歲患者的第三磨牙，取出牙髓組織，用酶消化法得到單細胞懸液進行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)細胞可以自我增殖，其免疫表型與骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow stromal stem cells，BMSC)相似，在體外一定條件下可形成礦化結(jié)節(jié)；將細胞植于免疫缺陷的小鼠體內(nèi)，有牙本質(zhì)樣組織形成，證明其可分化為類成牙本質(zhì)細胞。牙髓間充質(zhì)干細胞是牙髓未分化的外胚間充質(zhì)細胞，具有高度增殖和克隆能力，在不同誘導(dǎo)劑的作用下，可分化為成牙本質(zhì)細胞、脂肪細胞和神經(jīng)樣細胞等多種細胞[5]。Chen等[6]證明，從冷凍保存牙髓組織中提取的間充質(zhì)干細胞不僅有向肝細胞樣分化的性能，而且分化后的細胞具有正常的核型，其功能接近正常肝細胞。本研究采用SHED治療肝硬化小鼠模型。SHED是起源于神經(jīng)嵴外胚層的多能造血干細胞，是成體干細胞家族的重要成員之一，不僅能分化為典型的中胚層細胞系，如成骨、軟骨等，也能分化為外胚層和內(nèi)胚層細胞系，如肝細胞、胰島素樣細胞等[7]。

SHED較MSC具有更高的增殖活性和端粒酶活性，以及較低的免疫原性、致瘤性、凋亡性和衰老性，在第10代仍可保持其梭形細胞形態(tài)，可用于自體干細胞庫的構(gòu)建[8-10]。除此以外，SHED具有介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)的功能[16],在細胞免疫及治療炎癥相關(guān)疾病方面有意義[11]。

本研究顯示，經(jīng)尾靜脈注射SHED治療的肝硬化小鼠的體質(zhì)量增長，肝臟濕重均較未治療組肝硬化小鼠有所恢復(fù)；同時，血清肝功能指標(biāo)及肝臟的纖維化程度及炎癥浸潤程度均有所改善，在動物實驗中驗證了SHED對肝硬化具有一定的治療作用，能夠起到修復(fù)肝細胞的作用，減輕肝細胞的炎癥反應(yīng)，并能進一步逆轉(zhuǎn)肝硬化小鼠的肝臟纖維化及炎癥程度。與此同時，本研究在小鼠體內(nèi)驗證了SHED的安全性。

結(jié)合既往的SHED相關(guān)研究[12]，歸納了SHED移植療法存在以下優(yōu)點：①與原位移植治療相比，不受供體肝源短缺的限制，且免疫原性低，可有效避免免疫排斥反應(yīng)和免疫抑制劑的使用；②SHED來源豐富，可通過無創(chuàng)技術(shù)便捷取材；③治療效果明顯，可顯著改善肝功能、肝臟纖維化程度；④治療過程操作簡便，創(chuàng)傷小，患者能耐受治療過程。

對于SHED治療肝硬化的分子作用機制，仍需要進一步驗證。既往的機制研究包括：①SHED可分化為肝細胞樣細胞[13]，在肝臟損傷微環(huán)境的影響下，SHED在損傷部位進行定植、增殖，并分化成為肝細胞樣細胞發(fā)揮作用，參與肝臟新生組織的形成；②SHED具備強大的分泌功能，可分泌細胞外基質(zhì)的有效成分及多種營養(yǎng)因子[14]，從而形成利于組織再生以及微環(huán)境的修復(fù)；③在肝損傷環(huán)境中SHED分泌不同水平的細胞因子，可能激活肝臟干細胞，促進肝細胞再生；④SHED通過高表達基質(zhì)金屬蛋白酶降解肝內(nèi)過量沉積的ECM，減輕肝纖維化，激活肝內(nèi)殘存肝細胞、Kupffer細胞，在一定程度上啟動內(nèi)源性肝細胞增殖過程和Kupffer細胞分泌MMP降解ECM等[15]；⑤SHED具有免疫調(diào)節(jié)功能，可使小膠質(zhì)細胞及巨噬細胞的表型由促炎性M1型轉(zhuǎn)變成抗炎性M2型，抑制CD4+T淋巴細胞增殖及其促炎癥細胞因子的釋放[16]，從而改善肝臟的炎性病變。

本研究初步評估SHED治療小鼠肝硬化模型的安全性及有效性，為今后進一步開展床牙髓干細胞治療肝硬化患者的臨床試驗提供可靠的動物實驗依據(jù)。