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        上調(diào)環(huán)狀RNA_8199表達對食管鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

        2021-06-08 07:37:54燕迪迪倪凱園姜國忠
        鄭州大學學報(醫(yī)學版) 2021年3期
        關鍵詞:環(huán)狀克隆試劑盒

        王 偉, 燕迪迪,丁 爽,倪凱園,姜國忠

        1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科 鄭州 450052

        食管癌在全球癌癥發(fā)病率中排名第7,病死率排名第6[1]。我國90%以上的食管癌病例是食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)[2]。由于ESCC起病隱匿,多數(shù)患者診斷時已是晚期,預后很差。因此,明確ESCC發(fā)生及發(fā)展的分子機制,探尋有效的生物標志物及治療靶標對于ESCC的早期診斷、精準治療和復發(fā)預測意義重大。環(huán)狀RNA是一類閉合成環(huán)的非編碼RNA,不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴[3]。目前的研究[4-6]表明環(huán)狀RNA參與了基因的翻譯調(diào)控并介導了多種腫瘤的進展。如環(huán)狀RNA_0000263在宮頸癌細胞系中的表達顯著增加,環(huán)狀RNA_0000263/miR-150-5p/MDM4調(diào)控軸可能通過影響p53基因的表達在宮頸癌的發(fā)病和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。環(huán)狀RNA_LDLRAD3在胰腺癌組織和細胞系中高表達,下調(diào)其表達可以通過調(diào)控miR-137-3p/PTN軸抑制胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[5]。環(huán)狀RNA_CDK13在肝癌細胞和組織中表達降低,上調(diào)環(huán)狀RNA_CDK13表達可顯著抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力,并改變細胞周期進程[6]。本研究檢測了環(huán)狀RNA_8199在ESCC細胞中的表達情況,探討上調(diào)環(huán)狀RNA_8199表達對ESCC細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。

        1 材料與方法

        1.1主要試劑與儀器RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司,胎牛血清購自以色列Biological Industries公司,胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊公司,基因組DNA(gDNA)提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司,SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購自TaKaRa公司,ABI7500熒光PCR儀購自美國ABI公司。RNase R購自北京天根生化科技有限公司。免疫熒光探針由上海吉瑪公司合成,雜交試劑盒購自廣州銳博生物技術有限公司,核漿分離試劑盒購自廣州博徠斯生物科技有限公司。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司,離心機購自德國Eppendorf公司,CCK-8購自日本同仁試劑公司,Transwell小室購自美國Coming公司。

        1.2細胞來源及培養(yǎng)人ESCC細胞系KYSE30、KYSE70、KYSE270、KYSE520、KYSE150、KYSE410購自ATCC細胞庫。細胞用含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為體積分數(shù)5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱。

        1.3RT-PCR檢測KYSE520細胞中環(huán)狀RNA_8199的表達Trizol法提取KYSE520細胞總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,用gDNA提取試劑盒提取KYSE520細胞gDNA,并將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA和gDNA進行PCR擴增。使用發(fā)散引物(上游引物5’-ATGTGGCCAATGGGTTTAAG-3’,下游引物5’-GCAAGCTCAACAGCATGAGA-3’)擴增環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本,使用聚合引物(上游引物5’-GAAACAGCAC CCAGGACTA-3’,下游引物5’-CTGATTGAATTCTG GTTCACAG-3’)擴增線性轉(zhuǎn)錄本,GAPDH(上游引物5’-GAGTCCACTGGCGTCTTCA-3’,下游引物5’-TGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3’)作為內(nèi)參,引物均由北京擎科生物技術有限公司鄭州分公司合成。將PCR 擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,后置于凝膠成像儀上觀察,拍照記錄。

        1.4Sanger測序鑒定環(huán)狀RNA_8199的環(huán)化剪接點序列從環(huán)狀RNA Base數(shù)據(jù)庫獲取環(huán)狀RNA_8199序列,據(jù)此設計一對引物以擴增包含反向剪切位點的序列,上游引物5’-GCTTCAGGTGTCTTCG CAAT-3’,下游引物5’-AATCTTCATTCCGTGAG GCAAT-3’。以KYSE150和KYSE410細胞的cDNA為模板進行PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳后,送河南尚亞生物技術有限公司完成測序驗證。

        1.5環(huán)狀RNA_8199在KYSE520細胞中的特性表達Trizol法提取KYSE520細胞中總RNA,將提取的RNA分為RNase R處理組和對照組各10 μg。RNase R處理組用20 U RNase R處理(2 U/μg),對照組用等量雙蒸水替代,于37 ℃孵育10 min。兩組分別取等量消化產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過qRT-PCR法檢測環(huán)狀RNA_8199和ATXN10 mRNA的表達,選用 GAPDH 作為內(nèi)參。反應體系共20 μL:SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL,ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL,上、下游引物各0.8 μL,滅菌蒸餾水6 μL,cDNA 2 μL。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。實驗重復3次。

        1.6細胞免疫熒光法和核漿分離法檢測環(huán)狀RNA_8199在KYSE520和KYSE270細胞中的亞定位①將KYSE520和KYSE270細胞以每孔6×104個細胞分別接種于12孔板里,棄去培養(yǎng)基,PBS浸洗3次;每孔中加入1 mL 40 g/L多聚甲醛,室溫下固定15 min,PBS洗滌3次;加入體積分數(shù)1%的Triton破膜15 min,用PBS洗滌3 次后加入體積分數(shù)10%的山羊血清室溫下封閉1 h;除去山羊血清,加入探針對環(huán)狀RNA_8199序列的反向剪接區(qū)進行熒光原位雜交,4 ℃過夜,PBS洗滌3次,每次5 min;熒光顯微鏡下觀察及照相。②根據(jù)核漿分離試劑盒說明對KYSE520和KYSE270細胞進行核漿分離,細胞漿定位內(nèi)參為S14,細胞核定位內(nèi)參為U2。qRT-PCR法分別檢測細胞核、漿中環(huán)狀RNA_8199的表達,選用GAPDH作為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。實驗重復3次。

        1.7細胞轉(zhuǎn)染及分組通過Lipofectamine 2000將高表達環(huán)狀RNA_8199的質(zhì)粒載體(環(huán)狀RNA_8199-OE)及陰性對照(環(huán)狀RNA_8199-NC)分別轉(zhuǎn)染到KYSE30和KYSE70細胞中,48 h后收集細胞并用于后續(xù)實驗。

        1.8CCK-8實驗檢測環(huán)狀RNA_8199對KYSE30、KYSE70細胞增殖能力的影響將轉(zhuǎn)染后的KYSE30、KYSE70細胞以每孔2×103個細胞分別接種于96孔板,培養(yǎng)24、48、72和96 h。每個時間點分別向孔中加入 10 μL CCK-8溶液,繼續(xù)孵育2 h,用酶標儀檢測450 nm波長處的OD值。實驗重復3次。

        1.9平板克隆形成實驗檢測環(huán)狀RNA_8199對KYSE30、KYSE70細胞克隆形成能力的影響將轉(zhuǎn)染后的KYSE30、 KYSE70細胞接種于6孔板中(每孔300個細胞),在37 ℃、體積分數(shù)5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)14 d,室溫下甲醛固定15 min,結晶紫染色15 min,沖洗并干燥后置于低倍鏡下觀察,含有50個細胞以上的集落視為一個克隆,計數(shù)克隆數(shù)。實驗重復3次。

        1.10Transwell實驗檢測環(huán)狀RNA_8199對KYSE30細胞遷移和侵襲能力的影響細胞遷移實驗:將轉(zhuǎn)染后的KYSE30細胞加入無血清培養(yǎng)基中重懸,得到的細胞懸液調(diào)整至密度為2×105個/mL,上室中加入200 μL細胞懸液,同時將600 μL含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640加入下室,培養(yǎng)24 h后取出,甲醛固定后用結晶紫溶液染色30 min,PBS沖洗,于100倍鏡下選取5個視野觀察,計數(shù)穿過小室細胞數(shù)目。細胞侵襲實驗:用 Matrigel基質(zhì)膠涂于上室,余實驗步驟同上。實驗重復3次。

        1.11統(tǒng)計學處理采用SPSS 25.0進行數(shù)據(jù)分析。兩組間OD值的比較采用2×4析因設計的方差分析;細胞漿和細胞核中環(huán)狀RNA_8199相對表達量,兩組間環(huán)狀RNA_8199和ATXN10 mRNA相對表達量、細胞克隆形成數(shù)、遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)的比較采用兩獨立樣本的t檢驗。檢驗水準α=0.05。

        2 結果

        2.1KYSE520細胞中環(huán)狀RNA_8199的表達結果見圖1。環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本只能通過發(fā)散引物在cDNA中擴增出來,而線性轉(zhuǎn)錄本可通過聚合引物同時在cDNA 和gDNA中擴增出來。

        M:Marker;內(nèi)向箭頭指聚合引物,外向箭頭指發(fā)散引物

        2.2環(huán)狀RNA_8199環(huán)化剪接點序列的Sanger測序Sanger測序結果證實了環(huán)狀RNA_8199的環(huán)化剪接點序列,見圖2。

        圖2 環(huán)狀RNA_8199環(huán)化剪接點序列的Sanger測序結果

        2.3對照組與RNaseR處理組環(huán)狀RNA_8199、ATXN10mRNA相對表達量的比較結果見表1。RNase R處理后環(huán)狀RNA_8199對應的線性轉(zhuǎn)錄物ATXN10 mRNA表達水平下降,環(huán)狀RNA_8199的環(huán)狀轉(zhuǎn)錄物的表達水平無改變。

        表1 兩組環(huán)狀RNA_8199、ATXN10 mRNA相對表達量的比較(n=3)

        2.4KYSE520和KYSE270細胞中環(huán)狀RNA_8199的亞定位環(huán)狀RNA_8199主要定位于細胞漿中,見圖3。核漿分離實驗顯示,KYSE520和KYSE270細胞中環(huán)狀RNA_8199在細胞漿水平高于細胞核水平,見表2。

        圖3 細胞免疫熒光法檢測KYSE520和KYSE270細胞中環(huán)狀RNA_8199亞定位結果(×200)

        表2 KYSE520和KYSE270細胞漿和細胞核中環(huán)狀RNA_8199表達水平的比較(n=3)

        2.5上調(diào)環(huán)狀RNA_8199表達對ESCC細胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力的影響結果見表3、4。與環(huán)狀RNA_8199-NC組相比,環(huán)狀RNA_8199-OE組ESCC細胞OD值、克隆形成數(shù)、遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均下降。

        表3 兩組KYSE30、KYSE70細胞OD值比較(n=3)

        表4 兩組ESCC細胞克隆形成數(shù)、遷移細胞數(shù)與侵襲細胞數(shù)比較(n=3)

        3 討論

        食管癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤之一[1],據(jù)統(tǒng)計2017年全球新增食管癌病例約為47萬[2]。由于食管癌起病隱匿且侵襲性強,多數(shù)患者就診時已是晚期,5 a生存率不足20%[7]。因此,我們迫切需要進一步研究ESCC發(fā)生發(fā)展的分子機制,探尋有效的生物標志物及治療靶標。

        環(huán)狀RNA是一類表達穩(wěn)定且進化保守的非編碼RNA,自身或其調(diào)控通路的紊亂可導致多種疾病的發(fā)生。大多數(shù)環(huán)狀RNA存在于細胞質(zhì)中,通過與細胞質(zhì)中的miRNA和蛋白相互作用共同發(fā)揮調(diào)控功能[8]。證據(jù)表明環(huán)狀RNA在多種腫瘤中表達異常。如環(huán)狀RNA_FGFR1在非小細胞肺癌組織中表達上調(diào),通過海綿吸附作用與miR-381-3p共同導致非小細胞肺癌進展和免疫逃避的發(fā)生[9]。環(huán)狀RNA_LONP2在結腸癌組織中表達上調(diào),且可通過調(diào)節(jié)miR-17的成熟來增強結腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[10]。環(huán)狀RNA_MBOAT2在前列腺癌組織和細胞系中表達上調(diào),過表達環(huán)狀RNA_MBOAT2可以促進前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[11]。

        文獻[12-14]證實環(huán)狀RNA可以調(diào)控ESCC的進展并影響其預后,具有成為ESCC預測因子和治療靶點的潛力。環(huán)狀RNA_0004771在ESCC患者血漿和組織中表達上調(diào),并通過調(diào)控miR-339-5p/CDC25A促進ESCC進展[12]。環(huán)狀RNA_LARP4在ESCC細胞系中表達下調(diào),過表達環(huán)狀RNA_LARP4可以抑制ESCC細胞增殖和遷移并促進凋亡[13]。環(huán)狀RNA_0012563在ESCC中表達顯著上調(diào),敲低環(huán)狀RNA_0012563可以抑制XRCC1介導的EMT通路,從而抑制ESCC細胞的遷移和侵襲能力[14]。

        本研究首先采用RT-PCR法檢測了KYSE520細胞中環(huán)狀RNA_8199的表達情況,并進一步采用Sanger測序法鑒定了其環(huán)化剪接位點。環(huán)狀RNA的閉合成環(huán)結構使其與線性RNA相比,表達水平更加穩(wěn)定[15]。通過RNase R實驗發(fā)現(xiàn),RNase R處理后環(huán)狀RNA_8199的表達水平與對照組相比無明顯改變,而ATXN10 mRNA的表達水平與對照組相比明顯下降,證明了環(huán)狀RNA_8199相比于線性轉(zhuǎn)錄本更能抵抗RNase R消化作用。細胞免疫熒光和核漿分離實驗證明了環(huán)狀RNA_8199主要存在于細胞漿中。另外,本研究還探索了環(huán)狀RNA_8199對ESCC細胞生物學行為的影響。我們構建了高表達環(huán)狀RNA_8199質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)染ESCC細胞,通過CCK-8實驗、平板克隆形成實驗及Transwell 實驗發(fā)現(xiàn),上調(diào)ESCC細胞中環(huán)狀RNA_8199表達后,細胞的增殖活性明顯降低,細胞克隆形成數(shù)目明顯減少,侵襲與遷移能力明顯受到抑制。這表明環(huán)狀RNA_8199參與并影響了ESCC的發(fā)生發(fā)展,因此,有望成為ESCC基因治療的新靶點。

        綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA_8199與ESCC的發(fā)生發(fā)展有關,提示環(huán)狀RNA_8199可能是食管癌診療的有效靶點之一。然而我們的研究仍有一定的局限性,如環(huán)狀RNA_8199抑制ESCC細胞的增殖、遷移和侵襲能力的具體作用機制尚不清楚,因此,還需進一步探索環(huán)狀RNA_8199發(fā)揮各種生物學功能的具體機制。

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