林 銳,孔祥東,李曉麗
1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心 鄭州 450052 3)鄭州大學第一附屬醫(yī)院老年病科 鄭州 450052
家族性腺瘤息肉病(familial adenomatous polyposis,FAP)主要特征表現(xiàn)為結(jié)直腸布滿大小的腺瘤,息肉多于青少年期出現(xiàn),少數(shù)在幼兒時期開始生長,嬰兒時期未見生長。息肉數(shù)量初起時不多,而后隨著年齡增長而增多[1-3]。FAP全球發(fā)病率為1/10 000~1/7 000,是一種高度外顯的常染色體顯性家族性腫瘤綜合征,外顯率近100%,具有易復發(fā)和易癌變的特征,常惡變?yōu)榻Y(jié)直腸癌,與腺瘤性結(jié)腸息肉(adenomatouspolyposis coli,APC)基因突變有關(guān)[4]。APC基因的種系突變是導致FAP最常見的原因,APC基因定位于染色體5q21~5q22,含16個外顯子(其中第一外顯子不編碼),編碼具有8個亞結(jié)構(gòu)的APC蛋白。APC蛋白參與細胞周期的調(diào)控、凋亡、黏附遷移、信號轉(zhuǎn)導等過程,通過負性調(diào)控WNT/細連環(huán)蛋白通路抑制結(jié)直腸腫瘤發(fā)生[5-6]。第15外顯子突變最為多見,可長達6 574 bp,超過98%的突變是框移突變和無義突變,最終導致截短蛋白的產(chǎn)生。本研究采用高通量測序技術(shù)對4個FAP家系進行了突變篩查,報道如下。
1.1研究對象收集2017年4月至2019年11月就診于鄭州大學第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心并進行基因檢測的4個FAP患者,男、女各2例,年齡29~35歲。所有患者進行直腸指檢、體格檢查,血常規(guī)、糞便隱血試驗、腫瘤標志物CEA及CA19-9檢測,CT/MRI影像學檢查,直腸鏡、電子結(jié)腸鏡+病理活檢均符合FAP診斷標準。依據(jù)《遺傳學結(jié)直腸癌臨床診治和家系管理中國專家共識》[7],F(xiàn)AP的診斷標準:結(jié)直腸內(nèi)彌漫性息肉數(shù)量≥100個或者腺瘤性息肉數(shù)量<100個并伴有家族史或者先天性視網(wǎng)膜色素上皮肥厚。從該院遺傳與產(chǎn)前診斷中心DNA庫中隨機挑選200名健康對照,對照均排除腫瘤及全身疾病。研究對象均簽署知情同意書,本研究獲得該院醫(yī)學倫理委員會批準(KS-2018-KY-36)。
1.2FAP基因突變檢測
1.2.1 基因組DNA提取 抽取患者外周靜脈血2 mL,乙二胺四乙酸二鉀抗凝,通過磁珠法提取試劑盒(美國Omega Bio-tek公司)和自動化DNA提取設(shè)備(艾本德中國有限公司)提取樣本DNA,采用超微量分光光度計(GE Healthcare公司)測定DNA的濃度和純度,DNA濃度均大于30 mg/L,A260 nm/280 nm達1.8~2.0。
1.2.2 高通量測序和數(shù)據(jù)分析 結(jié)直腸癌相關(guān)基因panel(包括MUTYH、BMPR1A、PTEN、POLE、BLM、GREM1、TP53、SMAD4、STK11、POLD1、EPCAM、MSH2、MSH6、CHEK2、MLH1、APC、PMS2、GALNT12)在Ion torrent PGM高通量測序平臺(美國Thermo Fisher Scientific公司)靶向擴增并進行文庫構(gòu)建,制備模板并富集純化,加入測序引物和聚合酶后,在芯片上樣,通過Ion PGM擴二代測序(Sequencing 200 kit v2)試劑盒進行大規(guī)模平行測序。通過Ion Torrent Suite 4.0.2軟件處理分析高通量測序數(shù)據(jù),用序列比對插件、coverage分析插件、varrentcaller插件進行進一步分析;在Ion reporter軟件上參考人類基因組版本hg19(https://ionreporter.1ifetechnologies.com/ir/)進行變異注釋。
1.2.3 Sanger測序驗證 參考Ensembl數(shù)據(jù)庫基因序列,應(yīng)用Gene Tool軟件設(shè)計APC基因第15外顯子的引物,由上海生工生物有限公司合成(引物序列見表1)。純化PCR產(chǎn)物后采用ABI BigDye Terminator v3.1試劑盒測序,在ABI 3130XL 基因測序儀上進行直接雙向測序,最后用Chromas軟件分析測序數(shù)據(jù),尋找變異位點。
表1 APC基因外顯子引物序列
1.3突變命名及致病性判定通過dbSNP、1000G、ExAC和PubMed等公共數(shù)據(jù)庫對目標變異位點進行檢索,未在人類基因變異數(shù)據(jù)庫(human gene mutation database,HGMD)專業(yè)版記錄中記錄同時也未被公共數(shù)據(jù)庫和學術(shù)論文報道過的變異可視為新變異。新突變的命名參考國際基因突變命名體制(http://www.hgvs.org/mutnomen)的命名法命名;參照美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)指南,評判突變位點的致病性。
2.1臨床分析4個FAP家系中4名先證者的家系圖譜見圖1,臨床資料見表2。
□:正常表型男性;○:正常表型女性;■:男性患者;●:女性患者;箭頭所指為先證者
表2 FAP家系先證者一般情況
2.2FAP基因突變檢測結(jié)果家系1:先證者攜帶APC基因c.4348C>T(p.Arg1450Ter)[8]雜合變異,該變異為無義變異(圖2A),導致APC蛋白翻譯提前終止,使APC蛋白含量減少或功能缺陷,HGMD專業(yè)版數(shù)據(jù)庫已報道其與FAP相關(guān)。結(jié)合先證者病史及家族腫瘤史,初步判定先證者的臨床表型為APC基因突變所致。
家系2:先證者攜帶APC基因c.3629_3630delAT(p.Met1211Valfs*5)雜合變異(圖2B),該變異在正常人群中的頻率為零,為低頻變異,未見相關(guān)致病性報道,為新發(fā)現(xiàn)突變,根據(jù)Mutation Taster軟件及ACMG指南,初步判定該變異為疑似致病變異。結(jié)合先證者病史及家族腫瘤史,初步判定先證者的臨床表型為APC基因突變所致。
家系3:先證者攜帶APC基因c.4384_4385delAA(p.Lys1462Glufs*6)[9]雜合變異(圖2C),該變異為低頻變異,HGMD專業(yè)版數(shù)據(jù)庫已報道其與FAP相關(guān),根據(jù)Mutation Taster軟件及ACMG指南,初步判定該變異為疑似致病變異。家系分析顯示,先證者母親因腸癌去世無法追蹤突變來源,先證者妹妹同樣攜帶該變異,先證者父親該位點無突變。結(jié)合該家系的家族史,推測已故先證者母親為該突變導致的腸癌患者的可能性極大。
家系4:先證者攜帶APC基因c.3594_3595delAA(p.Lys1199Glufs*8)雜合變異(圖2D),該變異為低頻變異,未見相關(guān)致病性報道,為新發(fā)現(xiàn)突變,根據(jù)Mutation Taster軟件及ACMG指南,該變異初步判定為疑似致病變異。家系分析顯示,先證者父親攜帶該變異,先證者母親該位點無突變,符合常染色體顯性遺傳方式及突變-表型共分離規(guī)律。
A~D:分別為家系1~4
腺瘤病理檢查和內(nèi)鏡下結(jié)直腸息肉數(shù)目是目前臨床診斷FAP的主要依據(jù),但某些消化道息肉疾病如Lynch綜合征、Peutz綜合征、MYH相關(guān)性息肉病、幼年性息肉綜合征、遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌等與FAP難以區(qū)別,這使明確臨床診斷困難。因此,通過基因測序技術(shù)進行分子診斷可以輔助臨床及早準確地進行診斷和治療。本研究利用高通量測序技術(shù)對FAP家系進行了全外顯子組檢測分析,具有耗時短、成本低、數(shù)據(jù)量足等優(yōu)點,檢測結(jié)果均經(jīng)Sanger測序驗證。
有研究[9-10]報道西方人群中APC基因突變類型與臨床表型相關(guān),突變密集區(qū)位于密碼子第1 027~1 354位,其中第1 061和1 309位密碼子的5 bp缺失是突變熱點,該突變導致的病變出現(xiàn)時間早、表型嚴重。第9外顯子、密碼子1~157位和1 595~2 843位的突變與輕型FAP相關(guān)(息肉小于100枚)[11]。本研究中,4例患者APC基因突變均發(fā)生在第15外顯子,與已有報道相同。
本研究中,4個家系檢出的APC基因分別為c.4348C>T(p.Arg1450Ter)、c.3629_3630delAT(p.Met1211Valfs*5)、c.4384_4385delAA(p.Lys1462Glufs*6)、c.3594_3595del(p.S1198fs)4個變異,均是位于第15外顯子的無義突變和框移突變,均可導致終止密碼子提前出現(xiàn)編碼截短蛋白,截短蛋白的出現(xiàn)可造成β連環(huán)蛋白進入細胞核增多進而導致多種癌基因表達,其中c.3629_3630delAT(p.Met1211Valfs*5)和c.3594_3595del(p.S1198fs)變異均為未報道過的變異。
本研究不僅拓展了FAP致病基因變異譜,而且為理解該病的分子病理機制提供了重要信息,對該病的準確診斷、家系的遺傳咨詢具有指導意義。針對這樣的家系應(yīng)詳細詢問家族史,當家族成員中有相似表型時,及時進行結(jié)腸鏡檢查同時結(jié)合基因檢測,及早監(jiān)測攜帶突變而尚無臨床表型的家庭成員,以預(yù)防結(jié)直腸癌變。
隨著FAP臨床表型與APC基因相關(guān)性認知的深入研究和進展,臨床工作者可利用更先進的遺傳篩查技術(shù)更早、更準確地對患者進行診斷和治療,基因檢測結(jié)果可與臨床診斷相輔相成。此外,無家族史的FAP群體篩查也應(yīng)受到重視,對于群體篩查,高通量測序也是一種適宜的技術(shù)。