宋亞萍，連小潔,2，高志鵬,2，侯丁煜，黃 棣,2，魏 延,2

(1. 太原理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，納米生物材料與再生醫(yī)學(xué)研究中心，太原 030024；2. 太原理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程研究所，材料強(qiáng)度與結(jié)構(gòu)沖擊山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030024)

0 引 言

在人體中，骨骼除了支撐人體外，還可以保護(hù)內(nèi)部器官；貯存礦物質(zhì)；在運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)中傳遞力。在日常生活中，衰老、感染、腫瘤、創(chuàng)傷、骨髓炎手術(shù)清創(chuàng)以及先天性疾病都可能導(dǎo)致骨組織的結(jié)構(gòu)完整性受到一定的破壞，臨床上稱為骨缺損。

目前，骨缺損有很多類型，例如骨折，臨床手術(shù)中保守的治療方法為對(duì)受損部位通過(guò)石膏、夾板、支具等進(jìn)行固定，手術(shù)治療方法為鋼板固定、經(jīng)皮穿針等，研究表明，保守的治療方法無(wú)法滿足患者對(duì)骨功能修復(fù)的要求，手術(shù)治療方法會(huì)引起相應(yīng)的并發(fā)癥[1]。再如骨不連，人體組織自身的修復(fù)潛能無(wú)法保證受損骨可進(jìn)行局部骨誘導(dǎo)生成新骨，且會(huì)在一定程度上引起炎癥流膿，從而產(chǎn)生積液，臨床上需要進(jìn)行骨移植治療[2]。最大程度減輕病人的痛苦，減少手術(shù)創(chuàng)傷，減少手術(shù)并發(fā)癥的幾率至關(guān)重要[3]。

對(duì)骨折引起的骨移位及骨裂縫，難以自我愈合的骨不連，制備一種骨黏合劑來(lái)輔助治療效果更佳，既可固定骨折，也可以減少甚至避免鋼板等金屬材料的植入[4]，暫時(shí)填補(bǔ)骨缺損帶來(lái)的組織空缺，減少機(jī)體由于處于不穩(wěn)定環(huán)境下而采取的一系列過(guò)激的保護(hù)措施，減少引發(fā)炎癥的概率，除此之外，還可以通過(guò)載藥誘導(dǎo)受損骨兩端骨細(xì)胞長(zhǎng)入骨黏合劑，并分泌有關(guān)物質(zhì)使其降解，從而完成骨重建。因此找到一種較為安全的骨黏結(jié)劑，使用注射器將其注射到缺損部位，實(shí)現(xiàn)微創(chuàng)修復(fù)就成了骨缺損患者的福音[5]。

本文研究旨在找到一種可降解性骨修復(fù)材料，在不影響骨的正常形態(tài)的情況下，填補(bǔ)骨缺損，一來(lái)減少炎癥的發(fā)生，二來(lái)作為缺損部位骨細(xì)胞長(zhǎng)入的支架，在骨重建的過(guò)程中逐漸降解。

人體骨在納米結(jié)構(gòu)上由無(wú)機(jī)物質(zhì)羥基磷灰石(hydroxyapatite, HA)晶體與有機(jī)蛋白(糖蛋白、膠原蛋白、蛋白多糖)按一定的比例組合而成，HA的含量決定了骨的力學(xué)強(qiáng)度[6]。為使新骨與原本骨結(jié)構(gòu)相似，骨黏合劑應(yīng)為與HA結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)從而更好的模擬人體骨結(jié)構(gòu)。HA晶型屬于六方晶系，在晶粒生長(zhǎng)過(guò)程中沿a、c軸的方向生長(zhǎng)或隨機(jī)生長(zhǎng)其晶體形態(tài)不同，目前研究發(fā)現(xiàn)，其沿c軸生長(zhǎng)的晶體形貌為板片狀，各性能也與人體內(nèi)HA更為相似[7-9]。

研究表明，磷酸鈣骨水泥(calcium phosphatecement,CPC)水化產(chǎn)物可逐步轉(zhuǎn)化為HA[10]，具有良好的生物相容性、生物安全性、自固化性、可塑性、可降解性、可載藥性[11-12]，因此磷酸鈣骨水泥更適合作為骨黏合劑來(lái)修復(fù)骨缺損。磷酸鈣骨水泥是由α-TCP、β-磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate,β-TCP)、磷酸氫鈣(dicalcium phosphatedehydrate,DCPD)、無(wú)水磷酸氫鈣(dicalcium phosphate anhydrate,DCPA)、磷酸四鈣(tetricalcium phosphate,TTCP)等兩種及兩種以上磷酸鈣鹽,由檸檬酸、生理鹽水、磷酸二氫鈉等固化液混合后形成的骨黏合劑[13]。其中磷酸三鈣(TCP)是一種重要的可吸收磷酸鈣生物材料，是磷酸鈣的中間相。TCP 由于其優(yōu)異的骨傳導(dǎo)性和生物降解性，已被用作骨替代物的理想候選物、生物可降解復(fù)合材料的無(wú)機(jī)填充物、評(píng)價(jià)細(xì)胞接種有效性、增殖、成骨分化的基質(zhì)、刺激骨愈合和骨生成的骨生長(zhǎng)因子的載體、藥物載體、發(fā)光材料和催化劑[14]。

α-TCP是目前臨床上理想的骨修復(fù)材料之一[15]，鈣磷比接近1.5，在與水混合后可以進(jìn)行鈣磷原子重排獲得鈣磷比為1.67的羥基磷灰石，但其降解速度慢于新骨形成的速度[16]，如果應(yīng)用于臨床，可能會(huì)影響骨缺損的愈合。

為加快α-TCP的降解速度，本文將其與具有一定生物相容性和生物降解性，且降解速度將快的α-半水硫酸鈣(α-calcium sulfate hemihydrate, α-CSH)復(fù)合，并模擬人骨受力狀態(tài)，對(duì)其凝固時(shí)間、靜態(tài)力學(xué)性能、動(dòng)態(tài)力學(xué)性能、降解性能以及生物相容性進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 α-TCP的制備

α-TCP以碳酸鈣(CaCO3)，磷酸(H3PO4)，氫氧化鈣(Ca(OH)2)為原料，按式(1)～(3)制備得到磷酸三鈣(Ca3(PO4)2)后，經(jīng)程序控溫高溫煅燒至1400℃后獲得，程序控溫升溫步驟如圖1所示。

圖1 程序控溫升溫步驟Fig 1 Programmed temperature control step

CaCO3+2H3PO4→Ca(H2PO4)2+H2O+CO2↑

(1)

Ca(H2PO4)2+Ca(OH)2→2CaHPO4+2H2O

(2)

2CaHPO4+CaCO3→Ca3(PO4)2+H2O+CO2↑

(3)

1.1.2 α-CSH的制備

α-CSH以二水硫酸鈣(calciumsulphate dehydrate, CSD)為原料，經(jīng)水熱合成法獲得，將CSD置于立式壓力蒸汽滅菌器中(LDZF-30KB-Ⅱ，上海申安醫(yī)療器械廠)，溫度設(shè)為127 ℃，滅菌9 h，后置于烘箱中2 h即可獲得α-CSH。

1.1.3 固化液的制備

固化液為2.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的磷酸氫二鈉(sodium hydrogen phosphate, Na2HPO4)溶液，有研究表明，將Na2HPO4作為固化液，在降解過(guò)程中可致孔[17]。

1.2 α-TCP/α-CSH的制備

復(fù)合材料以α-TCP為主要占質(zhì)量比材料(占比分別為100%，95%，90%，85%，80%，75%)與α-CSH在攪拌器皿中混合后，按液固比(L/S)0.4 mL/g加入固化液，攪拌均勻，倒入模具，待其凝固后脫模，分別制備骨水泥柱與骨水泥粒用于力學(xué)性能與降解性能的研究，樣品尺寸如圖2。

圖2 樣品尺寸Fig 2 Size of samples

1.3 凝固時(shí)間的測(cè)定

凝固時(shí)間的測(cè)定選擇φ10 mm×15 mm的圓柱形模具，混合材料總質(zhì)量為3 g，加入固化液攪拌均勻后倒入模具，用攪拌勺加壓去除內(nèi)部氣泡并保證材料兩端平整，置于空氣中，利用維卡儀測(cè)定其凝固時(shí)間，α-TCP占比不同的材料每組設(shè)有5個(gè)平行試樣。

1.4 靜態(tài)力學(xué)性能的測(cè)定

將制備的φ10 mm×15 mm的骨水泥柱置于空氣中一周后，用砂紙將柱狀材料兩底面打磨光滑平整，利用萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)(INSTRON5544，英斯特朗公司)對(duì)其加載，采用位移控制的方式，設(shè)定其加載速度為1 mm/min，記錄其最大抗壓力，α-TCP占比不同的材料每組設(shè)有4個(gè)平行試樣。

1.5 動(dòng)態(tài)力學(xué)性能的測(cè)定

將制備的φ10 mm×15 mm的骨水泥柱，置于空氣中一周后，用砂紙將材料打磨光滑平整，利用萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)對(duì)其進(jìn)行動(dòng)態(tài)循環(huán)加載，加載方式模擬人行走時(shí)膝蓋受力的波形圖，加載方式通過(guò)軟件Bluehill Universal設(shè)定，由于α-TCP占比不同會(huì)影響其抗壓強(qiáng)度，所以設(shè)置動(dòng)態(tài)循環(huán)加載峰值時(shí)需參考靜態(tài)力學(xué)性能測(cè)試中的結(jié)果，α-TCP占比不同的材料每組設(shè)有五個(gè)平行試樣。

1.6 掃描電子顯微鏡表征

掃描電子顯微鏡(SEM)(JSM-7100F，日本電子株式會(huì)社)表征測(cè)試選擇φ5 mm×3 mm的骨水泥粒，小粒在空氣中放置一周后進(jìn)行SEM試驗(yàn)。觀察其表面形貌。

1.7 降解試驗(yàn)

降解實(shí)驗(yàn)同樣采用φ5 mm×3 mm的骨水泥粒，α-TCP占比不同的材料每組設(shè)有八個(gè)平行試樣，以PBS緩沖液為降解液，利用集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101SZ，鞏義市科瑞儀器有限公司)對(duì)其進(jìn)行恒溫振蕩(90 r/min)，測(cè)試時(shí)間為12周，分別對(duì)2、4、6、8、10、12周的結(jié)果進(jìn)行分析，以材料失重率的形式顯示，計(jì)算失重率后對(duì)材料進(jìn)行SEM觀察。

動(dòng)態(tài)加載實(shí)驗(yàn)中的材料亦做降解實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方式同上。

1.8 X射線衍射分析

將降解2周的復(fù)合材料靜置，待干燥后通過(guò)X射線衍射儀(DX-2700BH，丹東浩元儀器有限公司)，設(shè)置步寬角度為0.05°對(duì)材料成分進(jìn)行分析。

1.9 細(xì)胞增殖檢測(cè)

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以CCK-8實(shí)驗(yàn)為主。α-TCP占比不同的材料每組設(shè)有4個(gè)平行試樣，一共3組，置于3個(gè)96孔板中。首先將培養(yǎng)好的細(xì)胞稀釋至2.5×105個(gè)/mL，制成細(xì)胞懸液，每個(gè)材料上加200 μL細(xì)胞懸液，分別培養(yǎng)2、4、6天，則細(xì)胞可接種于96孔板的材料上，之后將培養(yǎng)2、4、6天的96孔板分別取出，在每個(gè)比例材料中加入10 μL的CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，最后將150 μL的上清液移入新的96孔板，將上清液振蕩后放入酶標(biāo)儀，在450 nm處測(cè)試其吸光度。最終結(jié)果通過(guò)觀察細(xì)胞培養(yǎng)上清液的吸光度顯示。

2 結(jié)果與討論

2.1 凝固時(shí)間

骨水泥的最佳凝固時(shí)間為5～30 min，若時(shí)間過(guò)短，在材料注射過(guò)程中材料就會(huì)凝固在注射管內(nèi)；若時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，當(dāng)材料到達(dá)骨缺損部位后短時(shí)間內(nèi)難以塑形，可能會(huì)引起受損部位感染。由骨水泥的凝固時(shí)間結(jié)果柱狀圖(圖3)可得，當(dāng)α-TCP占比為100%時(shí)，平均凝固時(shí)間為36 min左右，相比骨水泥最佳凝固時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；α-TCP占比為95%時(shí)，平均凝固時(shí)間為7min左右；α-TCP占比為90%、85%時(shí)，其平均凝固時(shí)間在10min左右，較為適中；α-TCP占比為80%，75%時(shí)，凝固時(shí)間﹤5min，相比骨水泥最佳凝固時(shí)間過(guò)短。

圖3 不同比例的復(fù)合骨水泥的平均凝固時(shí)間Fig 3 Average setting time of composite bone cement with different proportion

2.2 靜態(tài)力學(xué)測(cè)試

對(duì)材料進(jìn)行靜態(tài)力學(xué)測(cè)試旨在檢測(cè)材料在注射入人體后所能承受的最大壓強(qiáng)，由結(jié)果柱狀圖4(a)可得，當(dāng)α-TCP占比為95%時(shí)，其可承受最大的壓強(qiáng)為2.7MPa，其次為α-TCP占比為85%的復(fù)合材料。因此，材料的力學(xué)性能適用于非負(fù)重區(qū)的骨修復(fù)。

圖4 靜態(tài)力學(xué)測(cè)試與動(dòng)態(tài)力學(xué)測(cè)試Fig 4 Static mechanics test and dynamic mechanics test: (a) compressive strength of composite bone cement with different proportions under static loading; (b) dynamic loading waveform of different proportion composite bone cement

2.3 動(dòng)態(tài)力學(xué)測(cè)試

對(duì)α-TCP占比不同的復(fù)合材料進(jìn)行循環(huán)加載，加載波形及大小如圖4(b)所示，此波形可近似模擬人站立行走時(shí)脛骨關(guān)節(jié)所受的力[18]。由于α-TCP占比不同，其在靜態(tài)載荷下可承受的最大壓力不同，在動(dòng)態(tài)載荷下可承受的壓力也不同，所以對(duì)不同的材料設(shè)計(jì)的波形壓力最大值也不同。其中α-TCP占比為95%的復(fù)合材料可承受壓力的峰值最大，可達(dá)200N，α-TCP占比為100%的復(fù)合材料可承受壓力的峰值最小。

2.4 降解實(shí)驗(yàn)

圖5(a)為不同比例未加載復(fù)合材料降解失重率對(duì)比圖，降解時(shí)間為12周。對(duì)于未加載的復(fù)合材料，其在降解實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)α-TCP占比為75%時(shí)，材料發(fā)生質(zhì)量損失，當(dāng)α-TCP占比為80%、85%、90%、95%、100%時(shí)，材料幾乎沒(méi)有失重。但相比而言，失重率在上下波動(dòng)，說(shuō)明復(fù)合材料一方面進(jìn)行降解，一方面發(fā)生水化，其水化過(guò)程主要是α-CSH作為非均勻形核的基底引起的磷酸三鈣晶體形成。在PBS緩沖液的作用下復(fù)合材料吸收其鈣磷原子發(fā)生原子重排，使HA晶體得以生長(zhǎng)，降解過(guò)程與水化過(guò)程發(fā)生動(dòng)態(tài)協(xié)調(diào)。但當(dāng)α-CSH含量過(guò)多時(shí)，在液體環(huán)境中易發(fā)生潰散，導(dǎo)致復(fù)合材料發(fā)生質(zhì)量損失。

圖5(b)為不同比例復(fù)合材料在未加載及加載動(dòng)態(tài)載荷情況下降解兩周的失重率對(duì)比。當(dāng)材料經(jīng)過(guò)動(dòng)態(tài)加載以后，復(fù)合材料的失重率相比未加載增大，說(shuō)明動(dòng)態(tài)載荷會(huì)影響材料的降解，使降解速度加快。

圖5 降解失重率對(duì)比Fig 5 Comparison of degradation weight loss rate: (a) comparison of degradation weight loss rate of unloaded composites with different proportion; (b) comparison of weight loss rate of different proportion composites under unloaded and dynamic loading after 2 weeks

2.5 掃描電鏡表征

圖6為未加載荷的復(fù)合材料電鏡形貌圖。圖6(a)～(f)分別為α-TCP占比為100%、95%、90%、85%、80%、75%的復(fù)合骨水泥材料降解0、6、12周的形貌圖。在降解0周時(shí)，復(fù)合材料均為無(wú)規(guī)則狀，在發(fā)生降解后，復(fù)合材料SEM表征為板片狀結(jié)構(gòu)，說(shuō)明復(fù)合材料在降解過(guò)程中，晶體沿六方晶系中c軸進(jìn)行生長(zhǎng)[9-11]，逐漸形成人體內(nèi)HA晶體結(jié)構(gòu)，與降解實(shí)驗(yàn)中材料的失重率結(jié)果形成呼應(yīng)，表明材料在降解過(guò)程中以α-CSH為基，發(fā)生了水化。

圖6 未加載荷復(fù)合材料降解0、6、12周形貌圖Fig 6 Characterization of 0, 6, 12 weeks degradation of unloaded composites

2.6 X射線衍射結(jié)果

圖7為復(fù)合材料在降解兩周后的XRD譜圖。由標(biāo)準(zhǔn)卡可知，HA的特征衍射峰主要出現(xiàn)在2θ=25.86°，28.93°，31.75°，32.17°，34.05°，46.68°，50.49°，53.17°，α-TCP的特征衍射峰主要出現(xiàn)在2θ=27.76°，31.02°，34.37°，46.98°，52.94°。由圖可知復(fù)合材料在降解過(guò)程中，始終有α-TCP的衍射峰，說(shuō)明α-TCP可部分水化形成HA。當(dāng)α-TCP占比為100%、90%時(shí)，復(fù)合材料的XRD譜圖中HA的最高衍射峰較弱，說(shuō)明材料呈弱結(jié)晶狀態(tài)，當(dāng)α-TCP占比為85%時(shí)，HA的衍射峰出現(xiàn)頻率最高，隨著α-CSH含量增加，復(fù)合材料的衍射峰數(shù)量減少，峰值也有所減弱，說(shuō)明α-CSH的加入增大了鈣磷比例，使得材料更易向HA轉(zhuǎn)化。

圖7 復(fù)合材料的XRD譜圖Fig 7 XRD patterns of composite materials

2.7 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以材料吸光度(圖7)顯示，培養(yǎng)液吸光度增加，則細(xì)胞增殖。如圖7所示，材料在接種細(xì)胞培養(yǎng)2、4、6天后，培養(yǎng)液的吸光度逐漸增加，說(shuō)明細(xì)胞處于增殖的狀態(tài)，證明復(fù)合材料生物相容性良好，但α-TCP占不同比例的復(fù)合骨水泥材料其吸光度并無(wú)顯著性差異。

圖8 不同比例復(fù)合骨水泥細(xì)胞吸光度對(duì)比Fig 8 Comparison of cell absorbance of different proportion of composite bone cement

3 結(jié)論

由凝固時(shí)間實(shí)驗(yàn)可知，α-TCP占比為95%、90%、85%的復(fù)合材料降解時(shí)間在5～30 min，滿足骨水泥最佳凝固時(shí)間的要求。在靜態(tài)加載與動(dòng)態(tài)循環(huán)加載實(shí)驗(yàn)中，可承受壓力最大的材料α-TCP占比為95%，其可承受最大靜態(tài)壓強(qiáng)為2.7 MPa。在降解實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為材料的增重是磷酸鈣的水化過(guò)程與硫酸鈣降解過(guò)程的不斷協(xié)調(diào)平衡導(dǎo)致的，α-TCP以α-CSH為基從外到內(nèi)進(jìn)行層層降解并水化，內(nèi)部的水化對(duì)于Ca、P原子的攝取來(lái)自于上一層復(fù)合材料以及PBS緩沖液中的Ca、P原子，導(dǎo)致了材料表面的晶體不斷生長(zhǎng)，形態(tài)不斷改變，最終出現(xiàn)板狀纏結(jié)晶體結(jié)構(gòu)。在XRD衍射分析中可知，α-TCP在降解水化的過(guò)程中會(huì)部分轉(zhuǎn)化為HA，當(dāng)α-TCP占比為85%時(shí)，HA的衍射峰出現(xiàn)頻率最高。在細(xì)胞吸光度的檢測(cè)中可以看出，復(fù)合材料都是生物相容性良好的材料。