許 浩,魏 延,2,徐雙夢,蘇 慧,李涵琴,黃 棣,2,王楷群,2,胡銀春,2

(1. 太原理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，納米生物材料與再生醫(yī)學(xué)研究中心，太原 030024；2. 太原理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程研究所，材料強(qiáng)度與結(jié)構(gòu)沖擊山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030024)

0 引 言

手術(shù)切除、放療和化療依然是目前癌癥治療的三大主要方法[1-3]。手術(shù)對于良性腫瘤和非轉(zhuǎn)移瘤的治療效果顯著，但手術(shù)的創(chuàng)傷大，嚴(yán)重影響患者的正常起居，且手術(shù)切除的不徹底性會導(dǎo)致較高的復(fù)發(fā)率；放療和化療在一些癌癥治療方面已經(jīng)取得了良好的效果，但其毒副作用及耐藥性也導(dǎo)致其應(yīng)用受限。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)的不斷發(fā)展以及對腫瘤研究的日漸深入，靶向治療、免疫治療等新興療法大大提高了治療的精準(zhǔn)性，且毒副作用小，但治療費(fèi)用昂貴，且目前臨床上免疫治療尚未存在治療標(biāo)準(zhǔn)，所以尋找平價安全的癌癥治療方法仍然迫在眉睫。

癌癥難以治愈的根本原因在于其早期的難以診斷以及高轉(zhuǎn)移性，因此抑制癌細(xì)胞的增殖、運(yùn)動遷移等行為是一種較為直接高效的策略。目前抑制癌細(xì)胞遷移的方式多采用小分子干擾或抑制細(xì)胞的運(yùn)動信號通道等方式，但是該類方式依然無法避免耐藥性的產(chǎn)生。我們提出一種假設(shè)，通過在癌細(xì)胞表面包裹生物相容性良好的高分子或無機(jī)物，以物理約束的方式限制甚至抑制癌細(xì)胞的增殖及運(yùn)動行為，進(jìn)而達(dá)到治療癌癥的目的。

目前包裹癌細(xì)胞的方式有很多，其中較為簡單快捷地方式是層層自組裝[4]，即利用癌細(xì)胞表面微弱的負(fù)電荷在癌細(xì)胞表面反復(fù)交替沉積正、負(fù)聚電解質(zhì)，進(jìn)而在癌細(xì)胞表面包裹一層或多層聚電解質(zhì)。目前常用包裹的聚電解質(zhì)主要有聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDDA)、聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)[5]、明膠[6]、殼聚糖[7]、聚賴氨酸[8]、鞣酸(TA)、聚吡咯烷酮(PVPON)[9]等，但聚電解質(zhì)包裹只表現(xiàn)弱毒或無毒特性[10]，不具有殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。而腫瘤療法中應(yīng)用較廣的磁熱治療也只能利用腫瘤細(xì)胞的非耐熱性在藥物附近發(fā)揮療效，無法有效阻止癌細(xì)胞的逃逸。因此，利用具有一定的溫度敏感性的水凝膠限制癌細(xì)胞的遷徙及增殖有利于提高磁熱療的效能。

Chenite等人于2000年首次報(bào)道了一種基于殼聚糖-甘油磷酸鈉復(fù)合物(CS/GP)的水凝膠，此復(fù)合物具有溫敏性特點(diǎn)，即在室溫下保持液態(tài)，當(dāng)溫度升高到37 ℃ 后發(fā)生凝膠化，且注入人體后可降解為無毒的氨基葡萄糖被人體完全吸收[11]。后人通過優(yōu)化CS/GP配比，將其應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞[12]、胎鼠的大腦皮質(zhì)細(xì)胞[13]的培養(yǎng)以及兔頸動脈和腎動脈栓塞[14-16]等。

本文是在此研究的基礎(chǔ)上，制備了溫敏型 CS/β-GP 水凝膠，并用水凝膠包裹癌細(xì)胞，利用水凝膠的溫敏特性研究其對癌細(xì)胞的遷移性能以及生理活性的影響，以求為改善磁熱治療效能提供可能。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

脫乙酰度95%殼聚糖(CS，Aladdin)、冰乙酸(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)、β-甘油磷酸鈉(β-GP，SIGMA)、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、新生牛血清(四季青)，青霉素-鏈霉素溶液(HyClone)，RPMI 1640(Gibco)培養(yǎng)基。LIVE/DEAD? Viability/Cytotoxicity Kit 購自于美國Thermo Fisher 公司。

人卵巢癌細(xì)胞系(SK-OV-3)和人宮頸癌細(xì)胞系(HeLa)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，小鼠成纖維細(xì)胞(L929)來自太原理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究所。將細(xì)胞種植于含有10%新生牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的RPMI 1640培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 溫敏型CS/β-GP水凝膠的制備

將200 mg CS溶于9 mL冰乙酸(0.1M)中配成2%(w/v)的CS溶液，緩慢滴加，磁力攪拌1～2 h。溶解完全后高溫高壓滅菌30 min。

將560 mg β-GP溶于1 mL RPMI 1640培養(yǎng)基中，配成56%(w/v)的β-GP溶液，用0.22 μm濾器過濾除菌，4 ℃冰箱保存。冰浴15 min后，按體積比1∶3將56%β-GP溶液逐滴添加到2%CS溶液中，邊滴加邊輕輕搖晃，得到CS/β-GP水凝膠[17]。

圖1 癌細(xì)胞表面包裹水凝膠示意圖Fig 1 Schematic of the cancer cells encapsulated with hydrogel

1.2.2 SEM形貌及FT-IR圖譜

分別取2mL 2% 的 CS 溶液、56% 的 β-GP 溶液、室溫下未交聯(lián)的 CS/β-GP 混合溶液以及37 ℃ 交聯(lián)的CS/β-GP 凝膠于6孔板中，液氮驟冷后，冷凍干燥24h 取出。取適量樣品，使用場發(fā)射掃描電鏡(SEM，JSM-7100F，日本)和傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR，Bruke alpha，德國)對上述材料的形貌和結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

1.2.3 細(xì)胞劃痕

將細(xì)胞接種至12孔板，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，吸去培養(yǎng)基，用20 μL槍頭在孔道中央劃一條直線，然后用RPMI 1640培養(yǎng)基清洗2～3遍，最后給孔板加入水凝膠(每孔200 μL)。分別于相應(yīng)溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0 h、8 h、24 h 后用熒光倒置顯微鏡(ECLIPSE Ti，Nikon，Japan)觀察劃痕邊緣細(xì)胞的生長遷移情況。

1.2.4 熒光檢測

為進(jìn)一步評估溫敏性水凝膠對腫瘤細(xì)胞遷移性能的影響，設(shè)計(jì)用熒光染色(Calcein AM/EthD-1)檢測細(xì)胞包裹水凝膠后細(xì)胞的生理活性。根據(jù)細(xì)胞試劑盒的使用方法：將2.5 μL Calcein-AM和10 μL EthD-1加入5 mL PBS中來制備活/死儲備溶液。將細(xì)胞接種至玻片上，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，用RPMI 1640培養(yǎng)基清洗2～3遍，然后向載細(xì)胞玻片加入水凝膠(每片200 μL)并置于相應(yīng)溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。在室溫、黑暗環(huán)境中將儲備溶液滴加到涂覆水凝膠的細(xì)胞中靜置40min。用PBS洗滌細(xì)胞并用熒光抗猝滅劑密封，然后用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 水凝膠的溫敏特性

室溫下我們制備的水凝膠(圖2)為透明液體，在37 ℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)放置30 min中后即可凝固，但取出后一段時間(約20 min)便可融為液態(tài)。

圖2 CS/β-GP 混合物在室溫下以及37 ℃時狀態(tài)Fig 2 CS/β-GP mix at room temperature and 37 ℃

2.2 SEM形貌

圖3(A)為 CS 的SEM圖，可見 CS 分子交錯分布，但孔隙分布不均勻。圖3(B)為CS/β-GP 凝膠的SEM圖，可見β-GP 的加入使得CS分布均勻并形成貫通微孔結(jié)構(gòu)，有利于水及大分子物質(zhì)的遞送。

圖3 CS (A) 和 CS/β-GP (B) 的SEM圖Fig 3 SEM photos of CS and CS/β-GP dry hydrogel

2.3 FT-IR 圖譜

圖4 CS、β-GP和CS/β-GP 的FT-IR圖譜Fig 4 FT-IR spectrum of CS, β-GP and CS/β-GP dry hydrogel

2.4 劃痕法檢測水凝膠對細(xì)胞遷移性能的影響

從圖5看出，未加水凝膠的卵巢癌細(xì)胞在8 h就出現(xiàn)明顯的向中央劃痕區(qū)域遷移生長的現(xiàn)象，24 h 后中間劃痕區(qū)細(xì)胞數(shù)量明顯增多，間距縮小；而水凝膠包覆后的細(xì)胞在培養(yǎng)8 h 后細(xì)胞數(shù)量雖略有增加，但未見明顯的向劃痕區(qū)遷移的現(xiàn)象，隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞的遷移運(yùn)動基本停滯，劃痕區(qū)間距基本保持不變。

圖5 通過劃痕測定水凝膠對癌細(xì)胞系遷移的影響。注：圖中標(biāo)尺為100μmFig 5 Effects of hydrogels on the migration of cancer cell lines by the scratch wound healing assay. Note: the scale bar in the figure is 100 μm

2.5 熒光染色

Calcein-AM是一種可對活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，Calcein-AM由于在Calcein(鈣黃綠素)的基礎(chǔ)上加強(qiáng)了疏水性，因此能夠輕易穿透活細(xì)胞膜。當(dāng)其進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)后，酯酶會將其水解為Calcein留在細(xì)胞內(nèi),發(fā)出強(qiáng)綠色熒光[20]。EthD-1是一種紅色熒光染料，只能進(jìn)入死細(xì)胞。從圖6可以看出未涂覆水凝膠的卵巢癌細(xì)胞在顯微鏡激發(fā)下發(fā)出強(qiáng)綠色熒光，說明卵巢癌細(xì)胞活性良好；而添加水凝膠之后細(xì)胞幾乎都發(fā)出紅色熒光，說明水凝膠抑制了卵巢癌細(xì)胞的活性，卵巢癌細(xì)胞開始凋亡。

圖6 包覆水凝膠后卵巢癌細(xì)胞的活死熒光顯微圖像；注：圖中標(biāo)尺為100μmFig 6 Live and dead fluorescence microscopy images of SK-OV-3 cell covered with hydrogel after 24 h incubation. Note: the Scale bar in the figure is 100 μm

圖7顯示了水凝膠覆蓋的人宮頸癌細(xì)胞和小鼠成纖維細(xì)胞的活死熒光顯微圖像，可以看出水凝膠對卵巢癌細(xì)胞的抑制效果要略強(qiáng)于宮頸癌細(xì)胞，對宮頸癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞的抑制效果則明顯強(qiáng)于小鼠成纖維細(xì)胞?？梢宰C明，該水凝膠可抑制癌細(xì)胞的生理活性，而對正常細(xì)胞影響較小。

圖7 覆蓋水凝膠的宮頸癌細(xì)胞和小數(shù)成纖維細(xì)胞的活死熒光顯微圖像 注：圖中標(biāo)尺為100μmFig 7 Live and dead fluorescence microscopy images of SK-OV-3 and L929 cell covered with hydrogel after 24 h incubation. Note: the Scale bar in the figure is 100 μm

3 討 論

殼聚糖是天然生物多糖，來源廣泛，成本低廉，具有良好的生物相容性和可黏附性，在含溶菌酶的動物體內(nèi)能被降解為無毒的氨基葡萄糖，且在體內(nèi)不積聚、無刺激、無免疫原性，可被人體完全吸收利用，是良好的組織工程材料[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖脫乙酰度的增高有助于炎性反應(yīng)的減少，且殼聚糖的降解速度也與其脫乙酰度有關(guān)，脫乙酰度越高，生物降解速度越慢[23]。本文研究的最終目的是：用殼聚糖制備的水凝膠在體溫環(huán)境下可以憑借其溫敏凝固特性來抑制癌細(xì)胞的遷移運(yùn)動而對正常組織細(xì)胞不產(chǎn)生有害影響。 故本實(shí)驗(yàn)選擇95% 高脫乙酰度的殼聚糖，旨在減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生的同時，保持凝膠聚合物較慢的降解速度。

關(guān)于溫敏性水凝膠CS/GP的自凝機(jī)制。研究表明是由于β-甘油磷酸鈉的加入直接影響了殼聚糖鏈間的靜電力、疏水作用以及氫鍵作用[4]。加入β-甘油磷酸鈉后的弱堿作用使甘油磷酸鈉上的磷酸鹽和殼聚糖上的胺基相互吸引而使甘油部分暴露，殼聚糖鏈分解，故殼聚糖在較高的pH值下仍可保持液態(tài)[19]。加熱后，由于疏水鍵和氫鍵的引力大于鏈間的靜電排斥力，殼聚糖鏈間的部分片段發(fā)生物理結(jié)合，而表現(xiàn)凝膠化。本文所制備水凝膠的創(chuàng)新點(diǎn)在于用RPMI 1640培養(yǎng)基來溶解GP，使得加入β-甘油磷酸鈉后的堿性作用增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致殼聚糖在高pH環(huán)境下保持液態(tài)時間更久，這也是經(jīng)加熱后相較于他人研究的溫敏型CS/β-GP水凝膠凝固時間變長的原因。本文制備的溫敏型CS/β-GP水凝膠凝固時間為30 min，無論是體外研究還是體內(nèi)注射，都避免了水凝膠提前凝固的弊端，且RPMI 1640培養(yǎng)基的加入會提高水凝膠的生物相容性，有助于維持正常組織細(xì)胞的生理活性。

研究結(jié)果顯示，我們制備的溫敏型CS/β-GP水凝膠能選擇性的抑制癌細(xì)胞的生理活性，主要原因在于殼聚糖對癌細(xì)胞具有直接的抑制作用。目前殼聚糖抑癌機(jī)理主要有以下幾種原因：第一，癌細(xì)胞表面比正常細(xì)胞表面具有更多的負(fù)電荷，而殼聚糖帶陽離子特征表現(xiàn)正電荷，直接作用于癌細(xì)胞表面，從而抑制癌細(xì)胞的生長；第二，殼聚糖通過抑制丙酮酸激酶作用來抑制糖酵解過程，減少細(xì)胞的葡萄糖攝取和 ATP水平干擾癌細(xì)胞的代謝進(jìn)而發(fā)揮抑癌作用，但對正常肝細(xì)胞和肌細(xì)胞則沒有影響；第三，殼聚糖進(jìn)一步解聚可生成水溶性殼聚糖和低分子殼寡糖，殼寡糖可使癌細(xì)胞核碎裂、固縮、染色質(zhì)聚集，對腫瘤細(xì)胞有直接的抑制作用。除了殼聚糖對細(xì)胞的分子作用外，水凝膠的包裹相當(dāng)于對癌細(xì)胞表面施加應(yīng)力作用，具有抑制癌細(xì)胞遷移運(yùn)動的功效。

4 結(jié) 論

(1)以細(xì)胞培養(yǎng)基為溶液配制凝膠體系，成功制備了生物相容性良好、凝膠時間可控的溫敏型CS/β-GP水凝膠，該水凝膠在37 ℃ 下30min即可凝固，且降解速度緩慢。

(2)研究發(fā)現(xiàn)，用CS/β-GP水凝膠包裹癌細(xì)胞和小鼠成纖維細(xì)胞，水凝膠可明顯抑制癌細(xì)胞的遷移性能和生理活性，而對小鼠成纖維細(xì)胞的生理活性影響較小。

(3)用溫敏性水凝膠包裹癌細(xì)胞的方法無毒高效，且無需任何昂貴的抗腫瘤藥物便可達(dá)到抑制癌細(xì)胞活動的目的，為以后磁熱治療耦合殼化治療腫瘤提供了可能，有望成為腫瘤治療的新策略。