曾令州，周青青，顧 青，酈 萍

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 浙江省食品微生物技術(shù)研究重點實驗室 杭州310018）

草石蠶又名螺絲菜、甘露子，是一種唇形科水蘇屬多年生草本植物。原產(chǎn)地是中國，主要分布于云南、四川、貴州、西北和華北等地。草石蠶營養(yǎng)價值豐富，富含蛋白質(zhì)、多糖、多種礦物質(zhì)和維生素，口感脆爽鮮嫩且無纖維，是腌制泡菜的上好食材[1-2]。傳統(tǒng)的草石蠶腌制工藝是利用附著在草石蠶菜體上的乳酸菌等微生物，配合糖、醋等輔料進行自然發(fā)酵，這種腌制工藝雖然便捷，但是在腌制過程中會產(chǎn)生大量的亞硝酸鹽或滋生大量雜菌，導(dǎo)致產(chǎn)品亞硝酸鹽含量過高、霉變、腐敗，威脅人體健康。

乳酸菌通常被認為是食品級微生物，由于能產(chǎn)生獨特的風(fēng)味和具有抗菌作用而廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品中，其中利用乳酸菌制作泡菜類食品最為常見[3-5]。研究表明，乳酸菌在發(fā)酵過程中能有效降解亞硝酸鹽[6-7]，抑制泡菜中雜菌生長[8-9]；同時，乳酸菌發(fā)酵還能產(chǎn)生維生素[10-12]、多糖等營養(yǎng)成分[13]，提高泡菜產(chǎn)品的營養(yǎng)附加值。吳映明等[14]研究發(fā)現(xiàn)人工接種乳酸菌腌制甘藍泡菜，能有效降低甘藍泡菜的亞硝酸鹽水平。吳海清等[15]采用直投式乳酸菌粉腌制衛(wèi)青蘿卜泡菜能縮短發(fā)酵周期。目前，國內(nèi)外利用乳酸菌發(fā)酵草石蠶泡菜的研究鮮有報道。

本研究旨在篩選優(yōu)質(zhì)益生乳酸菌，并將其接種至草石蠶菜汁培養(yǎng)基發(fā)酵，模擬人工接種乳酸菌發(fā)酵草石蠶腌制泡菜。通過分析其發(fā)酵草石蠶菜汁時的生長特性、產(chǎn)酸特性、抑菌特性、B 族維生素含量等指標(biāo)，探究乳酸菌對草石蠶泡菜的影響。

1 材料與設(shè)備

1.1 菌種來源

本研究所用到的菌株如表1所示。

1.2 主要試劑和藥品

亞硝酸鈉、亞鐵氰化鉀、四硼酸鈉、乙酸鋅、鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、瓊脂粉、氯化鈉、硫酸錳、牛肉浸膏、七水硫酸鎂、檸檬酸二氫鉀、吐溫-80、無水乙酸鈉、磷酸氫二鉀、無水葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、瓊脂粉購于永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司。

1.3 培養(yǎng)基和緩沖液

1）MRS 液體培養(yǎng)基 蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、無水葡萄糖20 g/L、牛肉膏10 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、乙酸鈉5 g/L、七水硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.05 g/L、吐溫80 1 mL/L，121℃滅菌15 min。固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2%的瓊脂。

2）葉酸測定培養(yǎng)基（FACM）FACM 干粉配置成96.9 g/L 的溶液，121℃滅菌15 min。

3）LB 半固培養(yǎng)基 胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂粉1.2%，調(diào)節(jié)pH值至7.0，121℃滅菌15 min。

4）葉酸緩沖液 磷酸二氫鉀0.1 mol/L、磷酸氫二鉀0.1 mol/L、抗壞血酸0.1 g/L，調(diào)節(jié)pH 值至6.8，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 儀器和設(shè)備

pH 酸度計（PB-10）、電子天平（PL203），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；渦旋振蕩器（SW-2FD），上海醫(yī)科大學(xué)科學(xué)儀器廠；生物安全柜、小型離心機，美國Thermo 公司；生化培養(yǎng)箱（SPX-150B-Z 型），上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；尤尼柯2000 可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；全自動滅菌鍋，美國Tuttnauer公司；恒溫水浴鍋（DK-8D），上海精宏實驗設(shè)備有限公司；冷凍干燥機，德國Christ 公司；酶標(biāo)儀（SpectraMax 190），美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.5 試驗方法

1.5.1 草石蠶菜汁培養(yǎng)基的制備 將新鮮草石蠶洗凈后清水浸泡2 h，按料液比1∶1 的比例加水榨汁。菜汁用雙層紗布過濾2 次后離心20 min（4℃，10 000 r/min）。取上清液加入2%的葡萄糖和2%氯化鈉，121℃滅菌15 min 后備用[16]。

1.5.2 益生乳酸菌的篩選

1.5.2.1 菌株的活化 菌種活化：將-80℃保藏的菌種用劃線的方法活化。將乳酸菌、指示菌劃線于適宜的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)（見表1）。挑取單菌落于相應(yīng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。

表1 試驗菌株Table 1 Strains of experiments

1.5.2.2 優(yōu)勢菌的篩選 選自實驗室菌種保藏庫中的10 株乳酸菌經(jīng)活化后，按3%的接種量接至草石蠶菜汁培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h 后用紫外-分光光度計測定菌液OD600nm值。按OD600nm 值的大小選取生長情況良好的菌株進行后續(xù)試驗。

1.5.2.3 接種量的確定 將初篩獲得的植物乳桿菌ZJ316、副干酪乳桿菌ZFM54、沙克乳桿菌ZFM225 經(jīng)活化后，按1%，2%，3%，4%，5%的接種量接至草石蠶菜汁培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，利用平板涂布法測定草石蠶菜汁發(fā)酵液中的活菌數(shù)。

1.5.2.4 菌株生長曲線和產(chǎn)酸量的測定 將植物乳桿菌ZJ316、副干酪乳桿菌ZFM54、沙克乳桿菌ZFM225 活化后，按3%的接種量接入草石蠶培養(yǎng)基，每隔4 h 用紫外-分光光度計測定菌液的OD600nm值、pH 值和可滴定酸濃度。用0.05 mol/L 的NaOH 溶液進行酸堿滴定，并以酚酞溶液為指示劑指示滴定終點，可滴定酸度按式（1）計算：

式中，a——總酸度，%；NNAOH——NaOH 溶液的濃度，mol/L；VNaOH——NaOH 溶液滴定體積，mL；V樣品——樣品體積，mL。

1.5.2.5 亞硝酸鹽降解試驗 將活化的植物干桿菌ZJ316、副干酪乳桿菌ZFM54、沙克乳桿菌ZFM225 按3%的接種量接至含1% NaNO2 的草石蠶菜汁培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h，每6 h 取樣。參照國標(biāo)GB 5009.33-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的鹽酸萘乙二胺法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測定亞硝酸鹽含量，計算結(jié)果用降解率表示[17]。

1.5.2.6 抑菌試驗 利用牛津杯抑菌圈法測定植物乳桿菌ZJ316、副干酪乳桿菌ZFM54、沙克乳桿菌ZFM225 的抑菌性質(zhì)。將活化后的3 株乳酸菌，按3%的接種量接至草石蠶菜汁培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)24 h。草石蠶發(fā)酵液于8 000 r/min 離心5 min（4℃），取上清液備用。將抑菌試驗所需的指示菌在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，按1%的接種量接入50℃左右融化的半固培養(yǎng)基中，混合均勻后倒入牛津杯的平板上，待完全冷卻后拔出牛津杯。用移液槍吸取150 μL 發(fā)酵上清液加入孔洞中，37℃培養(yǎng)12 h 后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈大小。

1.5.2.7 產(chǎn)葉酸能力測定利用德國拜發(fā)IFP 維生素B9葉酸微生物法試劑盒對發(fā)酵樣品中的葉酸含量進行測定。按試劑盒中說明書要求對樣品進行處理，將處理后的樣品與培養(yǎng)基加入試劑盒自帶的微孔板中，用粘合箔封緊后于37℃黑暗條件下培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)完成后從培養(yǎng)箱中取出微孔板，再次壓緊粘合膜并在桌面上震蕩，使微生物在培養(yǎng)基中混合均勻。隨后輕輕撕下粘合膜，破壞微孔中的所有泡沫，并用酶標(biāo)儀在波長540 nm 處測定微孔的OD540nm值。

1.5.2.8 菌株發(fā)酵草石蠶菜汁產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

1）樣品處理 將活化后的植物乳桿菌ZJ316、沙克乳桿菌ZFM225、副干酪乳桿菌ZFM54按3%的接種量接種于草石蠶菜汁培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h 后取10 mL 裝入15 mL 頂空進樣瓶中，將頂空進樣瓶放到50℃水浴鍋內(nèi)加熱30 min，備用。

2）頂空固相微萃取條件 將老化后的萃取頭插入進樣瓶頂空部分，50℃平衡30 min、吸附30 min 后，將萃取頭取出并插GC 進樣口，同時啟動儀器采集數(shù)據(jù)，解吸20 min。

3）GC-MS 條件7890A/5975 GC/MS 聯(lián)用儀；色譜柱：HP-5MS 型（30 m×0.250 mm×0.25 μm）；載氣：氦氣；進樣溫度：230℃；進樣量：1 μL；升溫程序：初溫45℃保持2 min，以5℃/min速率上升至180℃，保持1 min 后以25℃/min 速率升到230℃，保持5.5 min。

4）數(shù)據(jù)處理 由計算機質(zhì)譜系統(tǒng)NSIT 檢索未知化合物，匹配度大于70%的結(jié)果將予以報告，采用面積歸一法計算各成分的含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

上述所有試驗均重復(fù)3 次。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)據(jù)分析使用Origin 9.0（OriginLab，USA）處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的初步篩選

乳酸菌在草石蠶菜汁培養(yǎng)基中的生長情況，不僅能夠反映出乳酸菌對草石蠶菜汁發(fā)酵環(huán)境的適應(yīng)能力，也是乳酸菌發(fā)酵性能分析的基礎(chǔ)，因此本研究通過生長情況測定初步篩選出優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌株。如圖1所示，培養(yǎng)24 h 后，植物乳桿菌ZJ316、副干酪乳桿菌ZFM54、沙克乳桿菌ZFM225在草石蠶菜汁培養(yǎng)基中生長情況最好，OD600nm值分別為1.84，1.64，1.58，本研究選擇這3 株乳酸菌進行后續(xù)試驗。

圖1 乳酸菌在草石蠶菜汁培養(yǎng)基中的生長情況Fig.1 Situation about lactic acid bacteria growing on Stachys sieboldii Miq juice medium

2.2 發(fā)酵性能的測定

2.2.1 最佳接種量的確定 接種量的多少與乳酸菌在培養(yǎng)基中生長情況密切相關(guān)，過小的接種量會導(dǎo)致乳酸菌生長密度偏低，而接種量過高則會出現(xiàn)營養(yǎng)匱乏導(dǎo)致菌體死亡的現(xiàn)象，因此確定一個最優(yōu)的接種量非常重要。如圖2所示，植物乳桿菌ZJ316 在3%接種量處有最高活菌數(shù)8.7×108CFU/mL、沙克乳桿菌ZFM225 在3%接種量處有最高活菌數(shù)1.7×108CFU/mL、副干酪乳桿菌ZFM54 在3%接種量處有最高活菌數(shù)2.3×108CFU/mL。因此，植物乳桿菌ZJ316、沙克乳桿菌ZFM225、副干酪乳桿菌ZFM54 的最佳接種量均為3%。

圖2 接種量對乳酸菌生長情況的影響Fig.2 Effects of inoculation on growth of lactic acid bacteria

2.2.2 生長特性如圖3所示，本次研究篩選出的3 株益生功能型乳酸菌ZJ316、ZFM225、ZFM54均能很好的適應(yīng)草石蠶菜汁培養(yǎng)基的發(fā)酵環(huán)境，這3 株乳酸菌均在培養(yǎng)8 h 達到指數(shù)生長期，16 h 達到平穩(wěn)期。其中以植物乳桿菌ZJ316 的生長情況最為良好，培養(yǎng)24 h 后OD600nm 值可達到1.824。

圖3 乳酸菌在草石蠶菜汁培養(yǎng)基上的生長曲線Fig.3 Lactic acid bacteria growth curve on Stachys sieboldii Miq juice medium

2.2.3 產(chǎn)酸特性 乳酸菌在發(fā)酵草石蠶等蔬菜的過程中會通過代謝生成乙酸、丁酸和乳酸等有機酸，使發(fā)酵體系pH 值下降，同時給泡菜產(chǎn)品帶來特殊風(fēng)味。如圖4和圖5所示，植物乳桿菌ZJ316、沙克乳桿菌ZFM225、副干酪乳桿菌ZFM54 在草石蠶菜汁培養(yǎng)基中都有一定的產(chǎn)酸能力，其中以植物乳桿菌ZJ316 的產(chǎn)酸能力最強，培養(yǎng)24 h 后使環(huán)境pH 值降到4.18，酸度達到0.45%。

圖4 乳酸菌在草石蠶菜汁培養(yǎng)基上pH 值的變化Fig.4 Changes of pH of lactic acid bacteria in Stachys sieboldii Miq juice medium

圖5 乳酸菌在草石蠶菜汁培養(yǎng)基上酸度的變化Fig.5 Changes of acidity of lactic acid bacteria in Stachys sieboldii Miq juice medium

2.3 降解亞硝酸鹽活性

研究表明，腌制食品在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量亞硝酸鹽，這些亞硝酸鹽會與人體內(nèi)仲胺類物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成強致癌物亞硝胺，嚴(yán)重威脅人體健康。乳酸菌在發(fā)酵過程中能夠顯著地降低體系內(nèi)亞硝酸鹽水平。

將亞硝酸鈉精確地配置成0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按要求繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品測定結(jié)果。如圖6所示，3 株益生乳酸菌ZJ316、ZFM225、ZFM54 在草石蠶菜汁培養(yǎng)基中都對亞硝酸鹽有一定的降解效果，其中以植物乳桿菌ZJ316 的降解活性最強，其亞硝酸鹽降解率達82.83%。

圖6 乳酸菌對亞硝酸鹽降解率的影響Fig.6 Effects of lactic acid bacteria for nitrite degradation

2.4 抑菌活性

乳酸菌在草石蠶菜汁培養(yǎng)基中發(fā)酵的過程會代謝出大量的有機酸導(dǎo)致環(huán)境pH 值下降，酸性環(huán)境會抑制部分雜菌生長；同時乳酸菌發(fā)酵過程中還會產(chǎn)生特有的細菌素，也能抑制部分有害菌的生長，這對保證乳酸菌發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品的健康安全起到至關(guān)重要的作用。表2為3 株益生乳酸菌發(fā)酵上清液的抑菌試驗結(jié)果，可以看出植物乳桿菌ZJ316 對所選指示菌均有較好的抑制效果，而沙克乳桿菌ZFM225 和副干酪乳桿菌ZFM54只對部分指示菌有一定抑菌作用。

表2 抑菌圈直徑Table 2 Diameter of inhibition zone

2.5 產(chǎn)葉酸能力

2.5.1 葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 按試劑盒說明書要求配置葉酸標(biāo)品（如表3所示），按照對應(yīng)質(zhì)量濃度梯度作出標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.7536x-0.0003（R2=0.9813），曲線線性較為良好，可以用來分析樣品葉酸的質(zhì)量濃度。

表3 葉酸標(biāo)品質(zhì)量濃度表Table 3 Mass concentration of folic acid standard

圖7 葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of folic acid

2.5.2 葉酸含量測定 取出微孔板后，用酶標(biāo)儀在指定區(qū)域讀出校準(zhǔn)標(biāo)品OD540nm值，并用試劑盒自帶分析軟件RIDARSOFT Win 分析得到校準(zhǔn)標(biāo)品質(zhì)量濃度為0.99 μg/100 mL（原質(zhì)量濃度為1.00 μg/100 mL），則檢測結(jié)果精確度為98.70%。之后用酶標(biāo)儀在指定區(qū)域讀出樣品的OD540nm值，并經(jīng)分析軟件RIDA?SOFT Win 分析得到3 株乳酸菌株產(chǎn)葉酸情況。結(jié)果顯示，3 株乳酸菌均有一定的產(chǎn)葉酸能力，培養(yǎng)48 h 后植物乳桿菌ZJ316、沙克乳桿菌ZFM225 和副干酪乳桿菌ZFM54 的平均OD540nm分別為0.942，0.474，0.640。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式y(tǒng)=0.7536x-0.0003，換算得到相應(yīng)的葉酸產(chǎn)量：植物乳桿菌ZJ316 葉酸產(chǎn)量為1.25 μg/100 mL，產(chǎn)量最高；沙克乳桿菌ZFM225 葉酸產(chǎn)量為0.63 μg/100 mL；副干酪乳桿菌ZFM54 葉酸產(chǎn)量為0.85 μg/100 mL。

2.6 草石蠶汁發(fā)酵所產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

經(jīng)頂空固相微萃取后進行GC-MS 分析，得到揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量。從表4中可以看出，共檢測出54 種物質(zhì)，其中醇類20 種、酯類5 種、酸類10 種、醛類5 種、酮類11 種、烷類2 種、其它類物質(zhì)2 種。3 組中相對含量均較高的物質(zhì)有異戊酸、乙酸、3-羥基-丁酮（乙偶姻）和2-壬酮。這些物質(zhì)應(yīng)為草石蠶泡菜的主要風(fēng)味成分。植物乳桿菌ZJ316 組共檢出41 種物質(zhì)，其中醇類15 種、酯類3 種、酸類7 種、醛類3 種、酮類9 種、烷類1種、其它類物質(zhì)2 種；沙克乳桿菌ZFM225 組共檢出19 種物質(zhì)，其中醇類5 種、酯類2 種、酸類2種、醛類3 種、烷類2 種、酮類5 種；副干酪乳桿菌ZFM54 組共檢出38 種物質(zhì)，其中醇類14 種，酸類9 種、酯類3 種、酮類8 種、醛類2 種、烷類1 種、其它1 種?？梢钥闯觯参锶闂U菌ZJ316 組在風(fēng)味物質(zhì)方面明顯優(yōu)于沙克乳桿菌ZFM225 組，略優(yōu)于副干酪乳桿菌ZFM54 組，使用植物乳桿菌ZJ316 發(fā)酵草石蠶可以賦予泡菜更好的發(fā)酵風(fēng)味。

表4 草石蠶汁揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分表Table 4 Volatile flavor components of Stachys sieboldii Miq juice medium

（續(xù)表4）

3 結(jié)論

傳統(tǒng)的草石蠶腌制工藝采取自然發(fā)酵的方式，該工藝生產(chǎn)的泡菜產(chǎn)品亞硝酸鹽含量高、易被雜菌污染等弊端明顯，而人工接種乳酸菌生產(chǎn)泡菜產(chǎn)品可以很好地避免和解決這類問題。本試驗將新鮮的草石蠶洗凈榨汁加入2% NaCl 和葡萄糖制成草石蠶菜汁培養(yǎng)基并接入乳酸菌來模擬乳酸菌發(fā)酵草石蠶的實際情況。從課題組保藏的乳酸菌中篩選出3 株（植物乳桿菌ZJ316、沙克乳桿菌ZFM225、副干酪乳桿菌ZFM54）在草石蠶菜汁培養(yǎng)基中的生長情況良好菌株，培養(yǎng)24 h 后其OD600nm分別為1.84，1.58，1.64。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在3 株菌中植物乳桿菌ZJ316 產(chǎn)酸能力最強，培養(yǎng)24 h 后使環(huán)境pH 降到4.18，酸度達到0.45%；降解亞硝酸鹽能力最強，培養(yǎng)48 h 后降解率可達到82.83%；產(chǎn)葉酸能力最強，培養(yǎng)48 h 后其葉酸含量可達12.5 μg/L；抑菌活性最強，其發(fā)酵上清對10 株指示菌均有不錯的抑制效果。GC-MS 分析表明，植物乳桿菌ZJ316 發(fā)酵能產(chǎn)出酸類、醇類、酮類等物質(zhì)，賦予草石蠶泡菜產(chǎn)品優(yōu)良的發(fā)酵風(fēng)味。植物乳桿菌ZJ316 的上述特性，可應(yīng)用于草石蠶泡菜發(fā)酵，改善泡菜風(fēng)味，提高產(chǎn)品附加值，為開發(fā)綠色、營養(yǎng)、健康的草石蠶泡菜產(chǎn)品及實現(xiàn)產(chǎn)品的升級換代奠定了理論基礎(chǔ)。