廖 滔，周 磊，2*，劉軍平，鄒立強(qiáng)，劉成梅，劉 偉，3

（1 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌330047 2 南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 南昌330031 3 江西師范大學(xué)國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心 南昌330022）

多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）廣泛分布于植物細(xì)胞內(nèi)[1]，因果蔬內(nèi)部組織的暴露而激活，可催化單酚羥基轉(zhuǎn)化為鄰二酚或?qū)⑧彿友趸甚?，而醌類物質(zhì)極易受到蛋白質(zhì)或氨基酸的親核攻擊生成黑色素，導(dǎo)致果蔬褐變[2]。發(fā)生褐變的果蔬感官品質(zhì)急劇下降，營養(yǎng)成分被破壞，難以被消費(fèi)者接受。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，高壓、熱、脈沖電場及化學(xué)抑制劑等處理手段在模型體系中對PPO活性展現(xiàn)出較好的抑制效果[3-5]。然而，與模型體系相比，相同處理手段在食品體系中的鈍酶效果具有較大差異，PPO 在食品體系中對熱和高壓鈍化的抵抗性普遍強(qiáng)于模型體系。本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)梨（cv.Packham）PPO 在模型體系（50 mmol/L，pH 6.0，McIlvaine 緩沖液）中經(jīng)70℃加熱10 min 后相對活性為16.7%[6]；在梨泥食品體系中經(jīng)90℃加熱10 min 后，其活性仍高達(dá)37.8%[7]。此外，Dalmadi 等[8]發(fā)現(xiàn)草莓（Fragaria ananassa）PPO在模型體系（100 mmol/L，pH 5.0，PBS）經(jīng)500～700 MPa 高壓處理15 min 后活性急劇下降，而Terefe等[9]報道PPO 在草莓泥食品體系中經(jīng)相同條件處理后活性無顯著變化。與食品體系相比，模型體系成分相對單一，食品體系中復(fù)雜的食品組分可能是這種差異形成的重要原因。

果蔬富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，其中果膠是一類由半乳糖醛酸及其衍生物組成的酸性雜多糖，廣泛分布于植物細(xì)胞的初生壁和中膠層中，構(gòu)成果蔬堅硬的質(zhì)地[10-11]。果蔬在鮮切、榨汁和制作果蔬泥等加工過程中，由于機(jī)械損傷作用果膠可與PPO發(fā)生自然接觸，同時果膠作為食品添加劑也被廣泛應(yīng)用于果蔬制品。另一方面，在果蔬貯藏及澄清果蔬汁的制作過程中果膠又常被降解或除去，因此果膠是果蔬加工過程中的一個可控制因素。近年來針對食品中生物大分子間相互作用的研究逐漸興起，其中以蛋白質(zhì)與多糖二元復(fù)合物為典型代表。有研究報道果膠可通過靜電相互作用、范德華力以及氫鍵等非共價作用力與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而使蛋白質(zhì)性質(zhì)發(fā)生改變[12-14]。因此，果膠作為一種果蔬加工過程中常被添加或去除的物質(zhì)，它與PPO 之間的相互作用很可能影響果蔬制品中PPO活性、穩(wěn)定性及酶促褐變的發(fā)生。研究果膠對PPO活性及穩(wěn)定性的影響，不僅有助于控制果蔬制品酶促褐變，也為探討食品組分影響酶促褐變的機(jī)理提供理論參考。

本文以蘑菇PPO 為主要研究對象，使用紫外分光光度計、熒光分光光度計等考察果膠對PPO酶促反應(yīng)活性、熱鈍化動力學(xué)、熱失活構(gòu)象變化以及抗壞血酸、檸檬酸、阿魏酸和水楊酸等有機(jī)酸抑制PPO 活性的影響，以期從食品組分角度解釋PPO 在模型體系和食品體系中出現(xiàn)穩(wěn)定性差異的原因，為果蔬實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用及褐變控制方法的選擇提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇PPO（T3824-250 ku，2 687 U/mg）、橘皮果膠（半乳糖醛酸≥74.0%），美國Sigma-Aldrich 公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸，上海西隴科學(xué)股份有限公司；水楊酸，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸、阿魏酸、左旋多巴（L-DOPA），上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600PC 型紫外-可見分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；超純水系統(tǒng)，法國Millipore公司；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省榮華有限公司；F-4500 型熒光分光光度計，日本日立儀器有限公司；pH 計，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果膠-PPO 溶液的制備 參考果膠在飲料及鮮果中所占的比重，以50 mmol/L pH 6.8 的磷酸緩沖液為溶劑配制不同質(zhì)量濃度的果膠溶液和0.35 mg/mL 的PPO 溶液以確保PPO 活性在合適范圍內(nèi)，將果膠與PPO 等體積混合使果膠質(zhì)量濃度最終分別為0，0.5，1，2，3，4，5，10 和20 mg/mL，PPO 終質(zhì)量濃度為0.175 mg/mL 并置于25℃恒溫孵育30 min。

1.3.2 PPO 活性的測定PPO 活性的測定參照Liu 等[15]的方法，將0.1 mL 混合酶液加入到2.9 mL 2 mmol/L L-DOPA 溶液中開啟反應(yīng)，使用紫外-可見分光光度計于25℃監(jiān)測其在波長475 nm 處1 min 內(nèi)吸光度的變化值，通過斜率可計算PPO 氧化L-DOPA 的活性，以未添加果膠的PPO樣品為空白對照。

1.3.3 熱穩(wěn)定性與熱鈍化動力學(xué)分析 參照Terefe 等[16]和周磊等[17]的方法，分別將PPO 與不同質(zhì)量濃度果膠的混合溶液置于45～60℃水浴鍋中處理不同時間，以樣品中心溫度達(dá)到既定溫度時開始計時，加熱結(jié)束后立即置于冰水浴中迅速冷卻[18]。其鈍化過程可用式（1）描述，通過線性回歸擬合可得到其鈍化動力學(xué)曲線。

式中，A0——初始酶活，U；At——t 時間的相對酶活性，U；k——鈍化速率，min-1；t——時間，min。

1.3.4 熒光光譜分析參考Liu 等[19]的方法略作修改。使用F-4500 型熒光分光光度計于25℃測定樣品的內(nèi)源熒光光譜，發(fā)射與激發(fā)狹縫寬均5 nm，激發(fā)波長280 nm，掃描波長范圍300～420 nm，掃描速度1 200 nm/min，所有光譜均通過不含PPO 的樣品光譜作為空白進(jìn)行修正。

1.3.5 抑制劑對PPO 的抑制作用 選用抗壞血酸、檸檬酸、阿魏酸和水楊酸4 種常見的有機(jī)酸，用濃度分別為0.6，1.2，1.8，2.4 mmol/L 的抗壞血酸溶液，濃度分別為5，10，15，20 mmol/L 的檸檬酸溶液，濃度分別為5，7.5，10，12.5 mmol/L 的阿魏酸溶液和濃度分別為1，4，7，11 mmol/L 的水楊酸溶液處理含5 mg/mL 果膠的PPO 溶液，30 min后測定其相對活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。利用SPSS 17.0 和Origin 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠對PPO 酶促反應(yīng)活性的影響

果膠對PPO 酶促反應(yīng)活性的影響如圖1所示。從圖中可以看出PPO 活性隨果膠質(zhì)量濃度的增加而略微下降，2 mg/mL 果膠使PPO 活性降低11.2%。隨著果膠質(zhì)量濃度增加至10 mg/mL，PPO相對活性進(jìn)一步降低至79.0%，此后增加果膠質(zhì)量濃度，PPO 活性不再發(fā)生明顯變化，說明果膠對PPO 活性具有一定的抑制作用，但抑制效果較弱，果膠對PPO 分子的包埋作用可能是導(dǎo)致其活性變化的原因之一。陳芳等[20]總結(jié)了近年來果膠作為包埋載體荷載生物活性成分的研究進(jìn)展，認(rèn)為果膠具有包埋功能性成分的潛能。Mashingaidze等[12]通過計算機(jī)模擬分子對接技術(shù)發(fā)現(xiàn)果膠能通過氫鍵和靜電相互作用與黏蛋白結(jié)合。Girard 等[21]研究報道果膠可與β-乳球蛋白形成復(fù)合物，且低酯果膠與蛋白的結(jié)合作用較高酯果膠強(qiáng)。果膠分子中游離的羧基可能與PPO 活性中心的銅離子形成配合物，球狀的PPO 分子被鏈狀的果膠分子包埋，從而使PPO 與底物的特異性結(jié)合受阻，催化活性降低。此外，有文獻(xiàn)報道蘑菇PPO 的最適pH 值在6.8 附近，所處環(huán)境低于其最適pH 值范圍的PPO 活性顯著下降[22]。果膠作為一種弱酸性多糖（pKa=3.5），果膠分子中大量羧基的電離使體系pH 值略微下降，如表1所示，20 mg/mL 果膠使體系pH 值降低0.68。雖然果膠對PPO 反應(yīng)體系pH 值的影響較小，但是許多研究表明PPO 對體系pH 值的變化十分敏感[23]。果膠對PPO 分子的包埋作用與其弱酸化作用都可能影響PPO 的酶促反應(yīng)活性。

圖1 果膠對PPO 酶促反應(yīng)活性的影響Fig.1 Effects of pectin on PPO enzyme activity

表1 果膠對PPO 反應(yīng)體系pH 值的影響Table 1 Effects of pectin on pH value of PPO reaction system with

2.2 果膠對PPO 熱鈍化動力學(xué)的影響

熱鈍化溫度范圍為45～60℃時，果膠對PPO熱鈍化動力學(xué)的影響如圖2所示，其熱鈍化速率如表2所示。由圖2a 可知，在不含果膠的情況下，經(jīng)45℃熱處理后PPO 發(fā)生輕微鈍化，熱處理20 min 后PPO 活性仍保持在50%以上，其鈍化速率為0.0308 min-1。隨著處理溫度的升高，PPO 熱鈍化速率逐漸加快，經(jīng)55℃熱處理3 min 后PPO 相對活性僅為33.5%；當(dāng)溫度升高至60℃時，熱處理1 min 可使PPO 活性降低50%以上，2 min 后PPO 基本失活，鈍化速率為0.8665 min-1。果膠的加入使PPO 對熱鈍化的敏感性降低。在相對溫和的熱處理?xiàng)l件下（50℃），PPO 熱鈍化速率為0.0502 min-1，而5 mg/mL 果膠使PPO 熱鈍化速率降低至0.0322 min-1（圖2b）。隨著果膠質(zhì)量濃度的增加，PPO 熱鈍化速率逐漸下降，當(dāng)果膠質(zhì)量濃度升高至10 mg/mL 時，PPO 熱鈍化速率下降至0.0254 min-1。熱處理溫度升高至55℃時，PPO 的熱鈍化速率具有相同的趨勢（圖2c），5，10，20 mg/mL 果膠使PPO 熱鈍化速率由0.2636 min-1分別下降至0.1733，0.1180，0.0865 min-1。從圖2d 可以看出，隨著熱處理溫度繼續(xù)升高，60℃熱處理2 min 使PPO 活性下降至19.7%，而5 mg/mL 和10 mg/mL 果膠能使PPO 活性分別保持為56.2%和58.0%，其熱鈍化速率分別降低了0.5804 min-1和0.6214 min-1。課題組前期研究報道蘑菇PPO 對熱十分敏感，高溫短時或低溫長時熱處理均能有效鈍化其活性[24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明果膠能增強(qiáng)PPO在50～60℃范圍內(nèi)的熱穩(wěn)定性，且這種增強(qiáng)作用呈現(xiàn)一定的質(zhì)量濃度依賴性。有研究報道稱蛋白質(zhì)與果膠間的相互作用會改變蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，這可能與果膠在蛋白表面形成緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[25]。熱處理通過誘導(dǎo)PPO 分子發(fā)生聚集或去折疊變化使其活性降低，鏈狀果膠對PPO分子的纏繞或包埋作用很可能保護(hù)PPO 結(jié)構(gòu)免受熱鈍化的影響，同時果膠分子中羧基基團(tuán)的氧原子可與PPO 分子中的氫原子形成氫鍵從而增強(qiáng)PPO 穩(wěn)定性，降低其熱鈍化速率。因此，果蔬制品如果蔬汁、果蔬泥及果醬等食品體系中果膠的存在可能使PPO 表現(xiàn)出更強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，也是PPO 在不同體系中熱鈍化動力學(xué)差異的原因之一。

表2 PPO 熱鈍化速率k（min-1）Table 2 Inactivation rate constants of thermal processed PPO（min-1）

2.3 果膠對PPO 熱失活構(gòu)象變化的影響

熒光光譜是一種通過測定蛋白質(zhì)酪氨酸和色氨酸殘基附近的極性環(huán)境反映蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的技術(shù)方法[26]。圖3a 為室溫25℃下未經(jīng)熱處理的PPO 熒光光譜。從圖3a 中可以看出，PPO 最大熒光發(fā)射峰出現(xiàn)在335.2 nm 處，而果膠能促使PPO熒光強(qiáng)度下降且熒光強(qiáng)度隨果膠質(zhì)量濃度的增加而急劇下降。當(dāng)果膠質(zhì)量濃度分別為0.5，1，2，3 mg/mL 時，PPO 相對熒光強(qiáng)度分別下降至81.5%、65.9%、44.3%和29.2%，說明果膠能影響PPO 附近的極性環(huán)境，使PPO 構(gòu)象發(fā)生一定程度的改變，且PPO 三級結(jié)構(gòu)的變化與圖1果膠對PPO 酶促反應(yīng)活性的影響相對應(yīng)。與相同條件下未經(jīng)熱處理的PPO 樣品相比，55℃熱處理誘導(dǎo)PPO 內(nèi)源熒光發(fā)生輕微的猝滅，同時PPO 最大熒光發(fā)射峰發(fā)生一定程度的紅移且紅移程度隨加熱時間的增加而增加（圖3b）。在無果膠存在的情況下，經(jīng)55℃熱處理9 min 后PPO 最大熒光發(fā)射波長發(fā)生2.6 nm 的紅移。隨著果膠質(zhì)量濃度的增加，熱處理對PPO 結(jié)構(gòu)的影響越不明顯。果膠質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 時，55℃、9 min 的熱處理使PPO 最大熒光發(fā)射波長發(fā)生2.2 nm 的紅移，隨著果膠質(zhì)量濃度增加至3 mg/mL，PPO 最大熒光發(fā)射波長僅發(fā)生0.4 nm 的紅移。以上結(jié)果表明熱處理能使PPO 三級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的改變，果膠的存在增強(qiáng)了PPO 在熱鈍化條件下構(gòu)象的穩(wěn)定，從而提高其熱穩(wěn)定性。

圖3 PPO 熒光光譜變化Fig.3 Changes of fluorescence emission spectra of PPO

2.4 果膠對PPO 抑制劑作用的影響

抗壞血酸、檸檬酸、阿魏酸和水楊酸4 種有機(jī)酸是應(yīng)用最為廣泛且高效的PPO 抑制劑。4 種有機(jī)酸均能顯著抑制PPO 活性且抑制作用表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性（圖4）。4 種有機(jī)酸中，抗壞血酸的抑制作用最強(qiáng)，其次是水楊酸和阿魏酸，檸檬酸的抑制效果最弱。1.2 mmol/L 抗壞血酸處理使PPO活性降低至53.1%，而要達(dá)到相同的抑制效果，水楊酸處理濃度需達(dá)到4 mmol/L，阿魏酸處理濃度需達(dá)到7.5 mmol/L 以上，檸檬酸處理濃度則需達(dá)到15 mmol/L。當(dāng)果膠質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時，4 種有機(jī)酸對PPO 活性的抑制作用略有增強(qiáng)。1.8 mmol/L 抗壞血酸處理后，PPO 活性的抑制率從56.9%增加至82.6%；15 mmol/L 檸檬酸處理后，PPO 活性的抑制率從52.6%增加至69.3%；7.5 mmol/L 阿魏酸處理后，PPO 活性的抑制率從32.2%增加至43.0%；1 mmol/L 水楊酸處理后，PPO 活性的抑制率從16.9%增加至26.1%。抗壞血酸、檸檬酸、阿魏酸和水楊酸普遍具有酸性且其中檸檬酸的酸性最強(qiáng)。如表3所示，5 mmol/L 檸檬酸處理后體系pH 值低于6.0，而15 mmol/L 檸檬酸處理后體系pH 值低于5.0。有研究報道檸檬酸的酸化作用是其對PPO 活性產(chǎn)生抑制作用的主要原因[27-28]；而抗壞血酸主要是因?yàn)槠鋸?qiáng)還原性，能將PPO 催化氧化形成的中間產(chǎn)物醌及時還原從而阻礙黑色素的生成[29]；阿魏酸和水楊酸2 種芳香族羧酸因具有與底物結(jié)構(gòu)相似的特點(diǎn)，能夠與底物競爭PPO 結(jié)合位點(diǎn)而產(chǎn)生抑制作用[30-31]。鏈狀果膠雖然可能對PPO 分子產(chǎn)生纏繞或包埋作用，然而抗壞血酸、檸檬酸、阿魏酸和水楊酸均為小分子，其簡單的結(jié)構(gòu)使其容易與PPO 分子發(fā)生接觸。此外，果膠的弱酸性可降低體系pH 值，從而增強(qiáng)有機(jī)酸對PPO 活性的抑制作用。

圖4 果膠對有機(jī)酸抑制PPO 活性的影響Fig.4 Effects of pectin on the inhibition of organic acids on PPO activity

表3 檸檬酸對PPO-果膠體系pH 值的影響Table 3 Effects on pH value of PPO-pectin mixture after treated with citric acid

3 結(jié)論

PPO 活性隨果膠質(zhì)量濃度的增加而逐漸下降，但其相對活性始終保持在75%以上。熱鈍化動力學(xué)結(jié)果顯示：PPO 鈍化速率隨熱處理溫度的升高而逐漸加快，但果膠的存在能顯著降低PPO 對熱鈍化的敏感性，從而增強(qiáng)PPO 熱穩(wěn)定性。熱處理使PPO 三級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，然而果膠能增強(qiáng)PPO 在熱鈍化下構(gòu)象的穩(wěn)定性。因此，食品體系中果膠的去除將有助于熱處理對PPO 的鈍化及果蔬酶促褐變的抑制。本研究從食品組分的角度出發(fā)探究果膠對PPO 活性及穩(wěn)定性的影響，為果蔬制品酶促褐變的控制應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中提供理論參考。