班齡尹，王笑園，龐思成，代毓敏，李景明，侯彩云

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083）

朝鮮薊【Cynara cardunculus L.var.scolymus（L.）Fiori】為菊科菜薊屬多年生草本植物，主要種植于地中海地區(qū)，起源于野生多年生的野生型刺菜薊【Cynara cardunculus L.var.sylvestris（Lamk）Fiori】[1]，是一種富含營養(yǎng)物質(zhì)的保健蔬菜，被認(rèn)為是一種功能性食品[2]，具有緩解肝膽疾病及消化不良、抗氧化、抗菌、抗癌等多種生理功能活性。朝鮮薊的可食部分為內(nèi)部苞片及花托，不可食用的工業(yè)副產(chǎn)物部分包括其外部苞片及莖葉，占整個(gè)植株鮮重的80%左右[2-3]，造成大量的土地占用、資源浪費(fèi)及環(huán)境污染，因此對朝鮮薊莖葉副產(chǎn)物的開發(fā)利用尤為重要。

萜類化合物是異戊二烯聚合物及其衍生物的總稱，而倍半萜化合物及三萜化合物是朝鮮薊中主要的親脂類化合物。Ramos 等[4]從刺菜薊【Cynara cardunculus L.var.Altilis（DC）】中提取了脂溶性成分并對其組分進(jìn)行系統(tǒng)分析，其中去酰基菜薊苦素、羽扇豆醇醋酸酯、Ψ-蒲公英甾醇醋酸酯在栽培型刺菜薊中均為第1 次報(bào)道。有文獻(xiàn)表明，萜類化合物具有抗高血脂[5]、抗炎[6]、抗癌[7]等生理活性，然而截至目前，對朝鮮薊副產(chǎn)物中萜類化合物的開發(fā)利用及相關(guān)活性的研究較少，對于其神經(jīng)保護(hù)作用的報(bào)道更是不足。

大量研究表明，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷與多種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，如阿爾茲海默癥和帕金森病等[8-11]。在神經(jīng)退行性疾病中，活性氧引起的氧化應(yīng)激被廣泛認(rèn)為是神經(jīng)細(xì)胞損傷的主要原因之一[12-13]?，F(xiàn)普遍認(rèn)為，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化的有效治療方法是保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受氧化損傷[14-15]。有大量研究證明，許多天然抗氧化物都具有神經(jīng)保護(hù)作用[16-20]。

本研究采用GC-MS 分析朝鮮薊副產(chǎn)物脂溶性提取物中萜類及甾醇類化合物的組成與含量，通過測定不同指標(biāo)研究脂溶性提取物對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，為朝鮮薊副產(chǎn)物的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

朝鮮薊（Cynara scolymus L.）的莖葉等副產(chǎn)物于2018年4月份采自于中國云南省曲靖市陸良縣中樞鎮(zhèn)華僑農(nóng)場，采收后當(dāng)天立即空運(yùn)送往實(shí)驗(yàn)室，液氮冷凍干燥、粉碎，過50 目篩，裝于自封袋中，于-20℃冰箱中保存。

正構(gòu)烷烴（C7～C40），上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；正十六烷（純度＞99.5%）、吡啶（純度＞99.9%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；菜薊苦素（純度96.4%）、豆甾醇（純度98%）、β-谷甾醇（純度95%）、羽扇豆醇（純度98%），天津阿爾塔科技有限公司；α-香樹脂醇（純度≥98%）、β-香樹脂醇（純度≥98%）、Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒，美國Sigma-Aldrich 公司；三甲基氯硅烷（純度＞99%）、N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（純度96%）、二氯甲烷（分析純級），上海麥克林生化科技有限公司；30% H2O2溶液，國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶，美國GIBCO 公司；胎牛血清，美國HYCLONE 公司；二甲基亞砜（DMSO）、PBS 緩沖液、DPBS 緩沖液、CCK8 試劑盒、DCFH-DA 試劑盒、吖啶橙-溴化乙錠（AO-EB）試劑盒，索萊寶生物科技有限公司；脂質(zhì)氧化（MDA）試劑盒、乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

6890N/5973 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技公司；BD FACSEALIBUR 型流式細(xì)胞儀，美國BD 公司；YG-XD 30 型熒光顯微鏡，中國PVD 公司；Tis 型倒置相差顯微鏡，日本Nikon公司；Infinite F50 型酶標(biāo)儀，澳大利亞TECAN 公司。

1.3 脂溶性物質(zhì)的提取

參考Romas 等[4]的方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱取朝鮮薊副產(chǎn)物凍干粉5 g，加入125 mL 二氯甲烷，索氏提取7 h，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃下對提取液進(jìn)行低壓干燥，旋蒸后加入二氯甲烷對干燥后的提取物進(jìn)行復(fù)溶，定容至25 mL，取1 mL 氮吹至徹底干燥，于-20℃冰箱中保存。

1.4 GC-MS 分析

參考Romas 等[4]的方法并稍作修改。在進(jìn)行GC-MS 檢測之前，先進(jìn)行三甲基硅烷化（TMS）衍生，向氮吹干燥后的脂溶性提取物中加入250 μL含1 mg 正十六烷（內(nèi)標(biāo)）的吡啶，待提取物完全溶解后，加入250 μL 的N，O-雙（三甲基硅烷基）-三氟乙酰胺和50 μL 的三甲基氯硅烷，混合物于70℃反應(yīng)30 min。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀配以DB-5 J＆W 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國安捷倫科技公司），載氣為高純氦氣（41 cm/s）。色譜的操作條件為：自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口溫度270℃，分流比30∶1。柱溫箱的升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?20℃，保持2 min，以4℃/min 的速度升至250℃，而后以2℃/min 的速度升至285℃，并保持15 min。質(zhì)譜的操作條件為：離子碰撞模式，離子能量70 eV，以全掃描模式進(jìn)行信息采集，掃描范圍為m/z 30～600，離子源溫度230℃。

GC-MS 色譜圖的處理軟件采用MSD Chem-Station 工作站（Agilent，Version E02）。定性時(shí)，通過將色譜峰的質(zhì)譜信息與相關(guān)文獻(xiàn)及工作站所匹配的NIST 質(zhì)譜庫進(jìn)行比較，必要時(shí)通過標(biāo)樣定性。定量時(shí)，主要的萜類及甾醇類化合物通過標(biāo)曲定量，其余化合物通過內(nèi)標(biāo)（正十六烷）定量，結(jié)果均折算為樣品中物質(zhì)的含量，用mg/kg DM 表示。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

參考Tang 等[21]的方法并稍作修改。將PC12細(xì)胞用完全培養(yǎng)基（RPMI 1640 培養(yǎng)基，10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素）接種于6 孔板中，接種密度3×105 個(gè)/mL，接種量2 mL/孔，置于37℃，5%CO2的水套式CO2 孵育箱中培養(yǎng)24 h。

1.6 細(xì)胞活力的測定

將PC12 細(xì)胞用完全培養(yǎng)基接種于96 孔板中，接種密度3×105個(gè)/mL，接種量100 μL/孔，于37℃，5% CO2的孵育箱中培養(yǎng)24 h。用不完全培養(yǎng)基（RPMI 1640 培養(yǎng)基，2%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素）將脂溶性提取物稀釋至高、中、低3 個(gè)不同的質(zhì)量濃度，分別處理PC12 細(xì)胞8 h 后，加入含90 μmol/L H2O2的不完全培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h。與預(yù)保護(hù)后傷害組相對應(yīng)，以未經(jīng)脂溶性提取物保護(hù)、經(jīng)H2O2傷害的PC12 細(xì)胞作為模型組，以未經(jīng)H2O2傷害、經(jīng)高濃度脂溶性提取物處理的PC12 細(xì)胞作為脂溶性提取物保護(hù)組，以未經(jīng)任何處理的PC12 細(xì)胞作為空白對照組，利用CCK8 法檢測每孔中細(xì)胞的存活率，參考Ding 等[22]的方法，將處理后的細(xì)胞移除培養(yǎng)基，加入100 μL/孔配好的CCK8 工作液，置于5% CO2 的孵育箱中，37℃孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測橘黃色甲臜的生產(chǎn)量，檢測波長450 nm 處的吸光度值，每組做6 個(gè)平行。

1.7 乳酸脫氫酶（LDH）漏出率檢測

細(xì)胞培養(yǎng)基中的LDH 含量是衡量細(xì)胞損傷程度的重要指標(biāo)，對按照1.5 節(jié)方法培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行4 組不同處理后，收集每孔中的培養(yǎng)基，按照試劑盒說明書檢測培養(yǎng)基中LDH 活性。

1.8 抗氧化活性的測定

氧化應(yīng)激會(huì)直接或間接導(dǎo)致ROS 介導(dǎo)的核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)損傷，并且涉及癌變[23]、神經(jīng)退行性病變[24]、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病[25]和衰老[26]等。在神經(jīng)退行性疾病中，活性氧（ROS）引起的氧化應(yīng)激被廣泛認(rèn)為是神經(jīng)細(xì)胞損傷的主要原因之一，本研究利用2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。對按照1.5 節(jié)方法培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行脂溶性提取物處理組、模型組、空白對照組3 組處理后，用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶消化細(xì)胞，于4℃，1 500 r/min 離心3 min 后使用完全培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，按照1∶1 000 比例用無血清培養(yǎng)基（RPMI1640培養(yǎng)基，1%青霉素-鏈霉素）稀釋DCFH-DA，取0.5 mL 稀釋液加入細(xì)胞，于CO2 孵育箱中避光孵育20 min，使用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3 次，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光情況，并用流式細(xì)胞儀量化檢測，檢測條件為激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長605 nm。對按照1.5 節(jié)方法培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行4組處理后，按照試劑盒說明書對細(xì)胞內(nèi)丙二醛（MDA）水平進(jìn)行檢測，來確定脂質(zhì)氧化的水平。

1.9 細(xì)胞凋亡的測定

對按照1.5 節(jié)方法培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行預(yù)保護(hù)后傷害組、模型組、空白對照組3 組處理后，用不含EDTA 的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，杜氏磷酸緩沖液（DPBS）洗滌細(xì)胞2 次，加入500 μL 去離子水稀釋好的結(jié)合緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，上機(jī)前加入5 μL 膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和10 μL 碘化丙啶（PI），室溫避光反應(yīng)10 min，細(xì)胞流式儀量化檢測，檢測條件為激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm。對按照1.5 節(jié)方法培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行預(yù)保護(hù)后傷害組、模型組、空白對照組3 組處理后，向每個(gè)細(xì)胞處理組的培養(yǎng)基中加入40 μL AO-EB 染液，室溫放置5 min，熒光顯微鏡拍照觀察。

2 結(jié)果和討論

2.1 朝鮮薊副產(chǎn)物的中萜類及甾醇類化合物

倍半萜烯類化合物及三萜是朝鮮薊中主要的親脂類化合物。倍半萜烯類化合物主要集中分布在葉片中，在莖干以及花蕾中含量較少，相反，三萜類化合物在葉片中含量較低[4，27]。本試驗(yàn)共鑒定出13 種萜類及甾醇類化合物，其中包括3 種倍半萜內(nèi)脂、2 種甾醇及8 種五環(huán)三萜（表1）。

由表1可知，朝鮮薊副產(chǎn)物中愈創(chuàng)木烷型倍半萜內(nèi)脂主要包括菜薊苦素、去?；怂E苦素和大海米菊素。菜薊苦素是朝鮮薊副產(chǎn)物中主要的倍半萜內(nèi)脂，也是朝鮮薊中一種主要的苦味成分，被視為朝鮮薊類植物的化學(xué)分類標(biāo)志[28]，在朝鮮薊中含量高達(dá)13 309.10 mg/kg DM，占總萜類及甾醇類化合物的64.90%，占總倍半萜內(nèi)脂的82.18%。研究表明菜薊苦素具有抗光老化[29-30]、抗痙攣[31]、抗高血脂[32]等藥理作用。

表1 朝鮮薊副產(chǎn)物脂溶性提取物中萜類及甾醇類化合物定性及定量Table 1 Qualitative and quantitative analysis of terpenoids and sterols in lipophilic extract from by-product of artichoke

朝鮮薊莖葉副產(chǎn)物中豆甾醇含量為264.67 mg/kg DM，β-谷甾醇含量為586.67 mg/kg DM，均屬于甾醇類化合物。植物甾醇是一種天然的植物活性物質(zhì)，是植物細(xì)胞膜的組成部分，具有較強(qiáng)的抗炎、降低膽固醇及預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等功效，而β-谷甾醇在減少血清膽固醇吸收方面作用顯著，在減少冠心病及控制腫瘤生長方面起著重要作用。

五環(huán)三萜類物質(zhì)是朝鮮薊副產(chǎn)物脂溶性提取物中含量較高的一類，占總萜類及甾醇類化合物的16.88%，其結(jié)構(gòu)主要分為羽扇豆烷型、蒲公英甾烷型和齊墩果烷型。其中，蒲公英甾烷型含量最高，占五環(huán)三萜總含量的58.93%，并且其兩種醋酸酯衍生物的總量為1 184.08 mg/kg DM，高于蒲公英甾醇和Ψ-蒲公英甾醇的總量（855.53 mg/kg DM），蒲公英甾醇和Ψ-蒲公英甾醇及其醋酸酯衍生物曾在朝鮮薊的花蕾中檢測出，具有顯著的抗炎活性[33]；羽扇豆醇含量為423.06 mg/kg DM，Noldin 等[34]也曾在朝鮮薊中發(fā)現(xiàn)羽扇豆醇，該化合物已被證實(shí)具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗關(guān)節(jié)炎及免疫調(diào)節(jié)功能[35]。齊墩果烷型五環(huán)三萜主要為α-香樹脂醇、β-香樹脂醇及β-香樹脂醇醋酸酯，其中醋酸酯衍生物的含量為535.86 mg/kg DM，高于兩種醇的含量，這與Romas 等[4]在刺菜薊（栽培型）的不同形態(tài)部位中得到的結(jié)果一致。Piccolella 等[36]在乳香黃連木（Pistacia lentiscus L.）葉片的提取物中發(fā)現(xiàn)了羽扇烷醇、羽扇豆醇、β-香樹脂醇、羽扇豆烯酮等萜類化合物，并且其粗提物具有預(yù)防或治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤的潛在功能。

2.2 PC12 細(xì)胞的細(xì)胞活力

利用CCK8 法對細(xì)胞活力進(jìn)行檢測。細(xì)胞存活率受脂溶性提取物質(zhì)量濃度和處理時(shí)間的影響（圖1），低質(zhì)量濃度（0.25 mg/L）下處理PC12 細(xì)胞，細(xì)胞存活率不受影響；隨著脂溶性提取物質(zhì)量濃度的增加（0.5～2 mg/L），PC12 細(xì)胞存活率顯著提高，并呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性，其中2 mg/L 的脂溶性提取物對細(xì)胞的保護(hù)作用最強(qiáng)，處理24 h后，存活率達(dá)到138.26%；然而，當(dāng)利用高質(zhì)量濃度的脂溶性提取物（8 mg/mL）處理細(xì)胞時(shí)，呈現(xiàn)出明顯的質(zhì)量濃度時(shí)間依賴性傷害作用。因此，選擇0.5，1，2 mg/L 3 個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 朝鮮薊副產(chǎn)物脂溶性提取物對PC12 細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of lipophilic extract of artichoke by-product on the cell viability of PC12 cells

與空白對照組相比，90 μmol/L H2O2處理PC12 細(xì)胞4 h 后，細(xì)胞存活率為48.05%（圖2）。經(jīng)脂溶性提取物預(yù)處理后，H2O2對PC12 細(xì)胞的損傷作用受到顯著抑制（P＜0.01），其中2 mg/L 的脂溶性提取物預(yù)處理細(xì)胞8 h 后，細(xì)胞存活率達(dá)到66.90%，因此在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，脂溶性提取物都可以顯著保護(hù)PC12 細(xì)胞免受H2O2 的損害作用。

圖2 朝鮮薊副產(chǎn)物脂溶性提取物預(yù)處理對H2O2誘導(dǎo)損傷的PC12 細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of pretreatment with lipophilic extract of artichoke by-product on the cell viability of H2O2-induced PC12 cells

2.3 PC12 細(xì)胞的LDH 漏出率

為了對脂溶性提取物的保護(hù)作用做進(jìn)一步研究，檢測了PC12 細(xì)胞的LDH 漏出率，即溶解細(xì)胞中釋放出的乳酸脫氫酶的含量，用該指標(biāo)評價(jià)細(xì)胞膜的受損程度。與空白對照組相比，90 μmol/L H2O2處理PC12 細(xì)胞4 h 后，其LDH 漏出率顯著增大（P＜0.01），達(dá)到194.69%（圖3）；經(jīng)脂溶性提取物預(yù)處理后，PC12 細(xì)胞的LDH 漏出率與模型組相比有顯著降低（P＜0.01），其中，2 mg/L 脂溶性提取物預(yù)處理細(xì)胞8 h 后，LDH 漏出率為110.28%，因此脂溶性提取物可以顯著地緩解H2O2對神經(jīng)細(xì)胞的損害作用。

圖3 朝鮮薊脂溶性提取物預(yù)處理對H2O2 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞LDH 漏出率的影響Fig.3 Effects of pretreatment with lipophilic extract of artichoke by-product on the cell LDH release of H2O2-induced PC12 cells

2.4 PC12 細(xì)胞中的ROS 水平及MDA 含量

ROS 主要來源于損傷的線粒體[39]，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS 或體內(nèi)氧化劑含量超過細(xì)胞的抗氧化應(yīng)答能力時(shí)，細(xì)胞就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激[40]。本試驗(yàn)以DCFH-DA 作為熒光探針，檢測2′，7′-二氯熒光素（DCF）的熒光強(qiáng)度即可獲知細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。與空白對照組相比，90 μmol/L H2O2處理PC12 細(xì)胞4 h 后，細(xì)胞內(nèi)ROS 水平顯著增加（P＜0.01），達(dá)到460.43%（圖4a），使細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化損傷；經(jīng)脂溶性提取物預(yù)處理后，能夠顯著地抑制PC12 細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生（P＜0.01），其中2 mg/L 脂溶性提取物預(yù)處理細(xì)胞8 h 后，ROS 含量為208.37%。熒光顯微鏡觀察染色后的PC12 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞呈現(xiàn)的熒光強(qiáng)度變化與細(xì)胞內(nèi)ROS 水平變化趨勢一致（圖4b）。因此，脂溶性提取物可以有效地清除ROS，緩解H2O2引發(fā)的線粒體功能障礙。

圖4 朝鮮薊脂溶性提取物預(yù)處理對H2O2 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響Fig.4 Effects of pretreatment with lipophilic extract of artichoke by-product on the intracellular ROS level of H2O2-induced PC12 cells.

當(dāng)動(dòng)物或植物體產(chǎn)生氧化應(yīng)激時(shí)，會(huì)發(fā)生脂質(zhì)氧化，而MDA 是一種生物體脂質(zhì)氧化的天然產(chǎn)物，可以用來確定脂質(zhì)氧化水平。與空白對照組相比，90 μmol/L H2O2處理PC12 細(xì)胞4 h 后，MDA含量顯著增多（P＜0.01），達(dá)到192.98%（圖5）；經(jīng)脂溶性提取物預(yù)處理8 h 后，能夠顯著地阻止MDA 的產(chǎn)生（P＜0.01）；而正常細(xì)胞經(jīng)脂溶性提取物處理后，在無H2O2傷害的情況下，其MDA 含量可降低至25.71%。

圖5 朝鮮薊脂溶性提取物預(yù)處理對H2O2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞內(nèi)MDA 含量的影響Fig.5 Effects of pretreatment with lipophilic extract of artichoke by-product on the intracellular MDA production of H2O2-induced PC12 cells

2.5 脂溶性提取物對PC12 細(xì)胞凋亡的影響

為了進(jìn)一步探究脂溶性提取物能否有效地抑制細(xì)胞凋亡，利用Annexin V-FITC/PI 進(jìn)行染色，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率（圖6a）。如圖6b所示，與空白對照組（8.14%）相比，H2O2處理顯著增加了細(xì)胞凋亡率（23.66%），經(jīng)朝鮮薊脂溶性提取物預(yù)處理后，PC12 細(xì)胞的凋亡得到顯著抑制。其中，經(jīng)過2 mg/L 脂溶性提取物預(yù)保護(hù)后，細(xì)胞凋亡率降低至8.75%。

為了更加直觀地比較不同處理組的細(xì)胞凋亡情況，利用AO-EB 對細(xì)胞進(jìn)行染色，通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。如圖6c所示，空白對照組的細(xì)胞因?yàn)檫灌こ龋ˋO）透過其完整的細(xì)胞膜嵌入DNA，幾乎全部呈現(xiàn)綠色熒光，細(xì)胞形態(tài)正常，沒有明顯的凋亡相關(guān)形態(tài)學(xué)改變；經(jīng)H2O2處理的模型組的細(xì)胞發(fā)生了邊緣化、核凝集等發(fā)綠色熒光的早期凋亡現(xiàn)象，并且因?yàn)殇寤义V（EB）透過其破損的細(xì)胞膜嵌入DNA，呈現(xiàn)出橘黃色熒光的晚期凋亡現(xiàn)象；而經(jīng)過朝鮮薊脂溶性提取物預(yù)處理的PC12 細(xì)胞呈現(xiàn)出早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞皆有減少的現(xiàn)象，并呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性。

圖6 朝鮮薊脂溶性提取物預(yù)處理對H2O2 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effects of pretreatment with lipophilic extract of artichoke by-product on cell apoptosis of H2O2-induced PC12 cells

3 結(jié)論

本試驗(yàn)探究了朝鮮薊副產(chǎn)物中脂溶性提取物對PC12 神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。利用GC-MS 對朝鮮薊副產(chǎn)物中萜類及甾醇類化合物進(jìn)行定性與定量分析，結(jié)果表明，主要含有3 種倍半萜內(nèi)脂，2種甾醇及8 種五環(huán)三萜。試驗(yàn)以H2O2 作為氧化損傷誘導(dǎo)劑，探究朝鮮薊副產(chǎn)物脂溶性提取物的生理活性，發(fā)現(xiàn)該提取物可降低PC12 神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷，并且伴隨細(xì)胞內(nèi)LDH 漏出率、MDA 含量及ROS 水平的降低。經(jīng)過Annexin V-FITC/PI 雙染及AO-EB 雙染后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)脂溶性提取物處理的PC12 細(xì)胞凋亡率顯著降低，與熒光顯微鏡的觀察結(jié)果一致。綜上，朝鮮薊副產(chǎn)物脂溶性提取物對PC12 神經(jīng)細(xì)胞具有抗凋亡及保護(hù)作用，值得進(jìn)一步的開發(fā)利用與研究。