劉雪飛，吳思楠，李秀霞，謝 晶，牟偉麗，郭曉華，李學(xué)鵬*，勵建榮

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧省食品安全重點實驗室生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州121013 2 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海201306 3 蓬萊京魯漁業(yè)有限公司 山東煙臺265600 4 山東美佳集團(tuán)有限公司 山東日照276800）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種嗜鹽性弧菌，屬于革蘭氏陰性短桿菌，該菌大多存在于近海岸的貝類和海水魚類等水產(chǎn)品中，有時也會出現(xiàn)在腌漬食品中，是世界上沿海地區(qū)引起食物中毒主要的食源性致病菌之一[1]。據(jù)估計，每年約有7 600 萬人患病，5 000 人死于食源性疾病，其中很大一部分歸因于沙門氏菌和副溶血性弧菌[2]。副溶血性弧菌最早是在1950年日本的一次由沙丁魚引起的大規(guī)模食物中毒事件中發(fā)現(xiàn)的[3]，之后逐漸在各國的沿海地區(qū)發(fā)現(xiàn)，并持續(xù)至今，已超過沙門氏菌成為世界食源性致病菌之首[4]。其感染途徑主要是食用未完全煮熟的海鮮類食品，進(jìn)而導(dǎo)致急性胃腸炎，甚至?xí)谷怂劳鯷5]。同時，副溶血性弧菌也是水生動物弧菌病爆發(fā)的病原體，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。深入研究副溶血性弧菌的防控技術(shù)，對促進(jìn)水產(chǎn)品的食用安全和海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有雙重意義。

由于在臨床治療和水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中廣泛使用抗菌劑，副溶血性弧菌中耐藥株的流行日益加劇，50%的臨床和環(huán)境分離株具有耐多藥性[6]。自1968年喹諾酮類藥物問世以來，臨床上一直未引入有效對抗革蘭氏陰性菌的新型抗生素[7]。細(xì)菌對現(xiàn)有抗生素已進(jìn)化出多種對抗機(jī)制，如通過主動外排系統(tǒng)增強(qiáng)藥物的外排作用，產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶使藥物失去活性，或?qū)⑺幬镒饔玫陌悬c加以修飾或改變等等[8]，急需尋找具有新的作用位點且安全有效的替代防治策略。

革蘭氏陰性菌之所以很難找到有效的抑制藥物，主要是因為其細(xì)胞的包膜結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，具有雙層膜結(jié)構(gòu)（位于內(nèi)側(cè)的細(xì)胞質(zhì)膜稱為內(nèi)膜，細(xì)胞壁最外層的膜稱為外膜），在兩層膜間為肽聚糖層，與外膜共同構(gòu)成細(xì)胞壁。外膜是革蘭氏陰性菌的特有構(gòu)造，具有典型的不對稱性磷脂雙層結(jié)構(gòu)，由脂多糖、磷脂和外膜蛋白構(gòu)成。一直以來，細(xì)胞與外界環(huán)境的物質(zhì)交換部位主要關(guān)注的是細(xì)胞質(zhì)膜，近10年間研究人員才開始關(guān)注外膜，尤其是外膜蛋白在物質(zhì)穿膜過程中的作用[9]。外膜蛋白包括連接外膜層與肽聚糖層的脂蛋白（Lipoprotein）和跨外膜的孔蛋白（Porin）。單體孔蛋白由8～22 個偶數(shù)跨膜鏈以反向平行方式通過相鄰鏈間的氫鍵作用形成β-桶狀結(jié)構(gòu)?？缒ゆ湹臄?shù)量決定孔蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致孔徑的不同[10]?？椎鞍卓梢赃x擇性地吸收各種營養(yǎng)物質(zhì)，同時也能阻攔多種有害大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞[11]。在去掉細(xì)胞壁的大腸桿菌原生質(zhì)體中，胞內(nèi)高積累化合物與胞內(nèi)低積累化合物之間的積累差異明顯變小，這一結(jié)果證實外膜是小分子在革蘭氏陰性菌中化合物積累的主要障礙[7]。吳賢斌等[12]曾將大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW 去除，發(fā)現(xiàn)缺失株對硫酸新霉素和氨芐青霉素的敏感性明顯增加。與親本株相比，在大腸桿菌孔蛋白OmpF/OmpC 缺失株中觀察到高積累藥物積累量顯著降低，說明小分子穿過外膜主要通過孔蛋白[7]。以上研究結(jié)果均顯示，細(xì)胞壁尤其是外膜對于革蘭氏陰性菌的生存是必不可少的，而去除細(xì)胞壁或是外膜對于革蘭氏陰性菌可能是致命的。

肉桂醇是我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中允許使用的食品香料，被證實對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑菌效果[13]。Mazzarrino 等[14]針對腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌篩選出21 種有抑菌活性的精油，發(fā)現(xiàn)肉桂的抑菌效果是有效的。目前關(guān)于肉桂醇對副溶血性弧菌的抑制作用及機(jī)理的研究尚未見報道，本文采用肉桂醇作為抑菌劑探究細(xì)胞壁的缺失對副溶血性弧菌生物學(xué)特性的影響，明確肉桂醇的作用靶點，為副溶血性弧菌的防控提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基和試劑

副溶血性弧菌（V.parahaemolyticus ATCC17802）保存于-80℃超低溫冰箱中。

3%氯化鈉堿性蛋白胨水（APW）、營養(yǎng)瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。以上培養(yǎng)基均121℃滅菌20 min。

肉桂醇、Tris、EDTA、硫酸粘桿菌素、十二烷基肌氨酸鈉（SLS）、SYBR Green I、PI，生工生物工程（上海）股份有限公司；溶菌酶、馬來酸鹽，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；考馬斯亮藍(lán)G-250，天津市福晨化學(xué)試劑廠；蔗糖、氯化鎂、磷酸二氫鉀、乙醇，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；磷酸、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；常用藥敏試紙，杭州濱和微生物試劑有限公司；牛血清蛋白，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器、設(shè)備

ZD-85A 氣浴恒溫振蕩器，金壇市科析儀器有限公司；真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GI54DS 型自動蒸汽壓力滅菌鍋，廈門致徽儀器有限公司；5804R 高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf中國有限公司；Czone5F 自動菌落計數(shù)儀，杭州迅數(shù)科技有限公司；perkin elmer v3 酶標(biāo)儀，成都必成豐瑞生物技術(shù)有限公司；UV-2550 紫外-可見分光光度計，日本島津公司；Scientz-IID 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；SDS 電泳系統(tǒng)、Gel Doc XR+凝膠成像儀，美國BIORAD 有限公司；Accuri C6 Plus 流式細(xì)胞儀，BD生物科學(xué)北京卓越中心。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌體活化及原生質(zhì)體制備 將副溶血性弧菌按1%的接種量加入APW 中，37℃、130 r/min培養(yǎng)12 h，連續(xù)培養(yǎng)2 代。

參考Xu 等[15]的方法制備副溶血性弧菌原生質(zhì)體。將活化的菌液置于4℃、6 000 r/min 離心收集菌體細(xì)胞。用0.01 mol/L Tris-Hcl（pH 7.0）洗滌3 次，細(xì)胞重懸于含有0.5 mol/L 蔗糖的0.01 mol/L Tris-Hcl（pH 7.0）中，緩慢加入EDTA 溶液（pH 8.0，20 min 之內(nèi)完成此步）至其終濃度為0.01 mol/L。37℃、100 r/min 振蕩20 min，獲得一組除去外膜層的細(xì)菌細(xì)胞（Outer membrane deficient group，OMDG），留此階段部分菌體冷藏備用。另一部分菌體在4℃、3 000 r/min 離心收集細(xì)胞，用SMM 緩沖劑（20 mmol/L 馬來酸鹽、0.5 mol/L 蔗糖、20 mmol/L MgCl2，pH 6.5）清洗2 次，細(xì)胞重懸于SMM 緩沖劑（含1 mg/mL 溶菌酶）中，37℃、100 r/min 振蕩30 min，除去肽聚糖層，緩慢滴加EDTA溶液（pH 8.0）使其終濃度為0.01 mol/L，放入37℃的培養(yǎng)箱溫育15 min，獲得一組去壁的細(xì)菌細(xì)胞（Cell wall deficient group，CWDG），將此原生質(zhì)體冷藏備用。未處理的菌體（Untreated group，UG）同樣冷藏備用。

1.3.2 最小抑菌濃度測定 采用二倍稀釋法處理肉桂醇原液（質(zhì)量濃度為1 g/mL），使其質(zhì)量濃度依次為原液的1/2 至1/2048。試管內(nèi)物質(zhì)組成為8.9 mL APW、1 mL 菌液（分別為UG、OMDG 和CWDG）和0.1 mL 不同質(zhì)量濃度的肉桂醇溶液。所有試管置于37℃培養(yǎng)24 h 后觀察菌體生長情況，使培養(yǎng)液保持澄清的最小藥物質(zhì)量濃度即為肉桂醇對副溶血性弧菌的最小抑菌濃度（MIC）。

1.3.3 細(xì)胞膜完整性測定 參考張赟彬等[16]的方法，將菌懸液在4℃、3 000 r/min 條件下離心15 min 收集菌體，磷酸緩沖液（pH 7.0）清洗并重懸。向新的離心管中加入10 mL 菌懸液和45 μL 肉桂醇（1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、空白），37℃培養(yǎng)6 h，在6 000 r/min 下離心3 min 收集上清液。在波長260 nm 處測定其吸光度值，即為菌液中核酸的含量。同時采用考馬斯亮藍(lán)法對上清液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色，測定其在波長280 nm 處的吸光度值，即為菌液中蛋白質(zhì)的含量。

1.3.4 硫酸粘桿菌素試驗參考Richter 等[7]的方法并適當(dāng)修改，先向96 孔板每孔中加入20 μL 硫酸粘桿菌素溶液（6 μmol/L）和178 μL 稀釋好的菌懸液，靜置30 min，再加入不同質(zhì)量濃度的肉桂醇（1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、空白）2 μL，混勻并置于37℃培養(yǎng)18～24 h 后用酶標(biāo)儀測定其在波長280 nm 處的吸光度值。

1.3.5 外膜蛋白的提取及質(zhì)量濃度測定 參考Chiu 等[17]的方法進(jìn)行外膜蛋白的提取，并稍作修改。在4 000 r/min、4℃條件下收集細(xì)胞，經(jīng)4℃生理鹽水洗滌3 次，重懸于少量體積的鹽水中，利用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎處理（300 W、冰浴5 min），間歇10 次完成。在5 000 r/min、4℃條件下離心20 min，收集上清；于15 000 r/min 離心40 min，沉淀重懸于2 g/100 mL SLS 中并在室溫條件下孵育1 h 后，于15 000 r/min 離心40 min，沉淀即為外膜蛋白。

利用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford 法）[18]測定獲得的外膜蛋白質(zhì)量濃度。首先利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。測定波長595 nm 處外膜蛋白樣品的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算出外膜蛋白的質(zhì)量濃度。

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Bovine serum albumin standard curve

1.3.6 外膜蛋白SDS-PAGE 采用非連續(xù)緩沖系統(tǒng)垂直板電泳，選用12%分離膠，5%濃縮膠。外膜蛋白樣品沸水浴5 min，加樣量為20 μL【16 μL 蛋白溶液+4 μL（5×）蛋白上樣緩沖液】，80 V 電壓進(jìn)行樣品濃縮，樣品進(jìn)入分離膠后加壓至120 V，當(dāng)溴酚藍(lán)即將跑出膠板時，停止電泳。膠板考馬斯亮藍(lán)染色后置于凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.7 外膜蛋白競爭試驗參考Lam 等[19]的方法進(jìn)行外膜蛋白競爭試驗，并作一定的改動。將50 μL 肉桂醇、50 μL 外膜蛋白（質(zhì)量濃度在2～512 μg/mL）加入96 孔板中，37℃下孵育1 h。之后向每孔中加入100 μL 副溶血性弧菌懸液（約2.5×106個/mL，使肉桂醇終質(zhì)量濃度為1/2 MIC），37℃下孵育2 h。各孔中取出50 μL 混合培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至第2 個96 孔板中，并加入100 μL 鹽水和染料混合物（即含有0.1% SYBR Green I 和0.1%PI 的鹽水），用流式細(xì)胞儀分析第2 個96 孔板中的各孔，確定細(xì)胞凋亡情況。

1.3.8 藥敏試驗 參考李莉等[20]的方法，向100 mL 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中分別加入500 μL 處理好的菌液（包括UG、OMDG、CWDG），混勻后倒平板，待培養(yǎng)基凝固后向每個平板中放入3 片相同的藥敏試紙（包括四環(huán)素、紅霉素、萬古霉素、環(huán)丙沙星、利福平），所有平板置于37℃培養(yǎng)18～24 h，測量抑菌圈直徑。

1.3.9 統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010 并繪制圖表，利用SPSS 19.0 對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，所有試驗均重復(fù)測定3 次，測定結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞壁缺失對副溶血性弧菌最小抑菌濃度的影響

在確定肉桂醇對副溶血性弧菌有抑菌活性基礎(chǔ)之上，采用二倍稀釋法測定3 組副溶血性弧菌（包括UG、OMDG、CWDG）的MIC，結(jié)果見表1，細(xì)胞壁缺失可以改變副溶血性弧菌對抑菌劑的敏感性。肉桂醇對UG、OMDG 和CWDG 的MIC 分別為原液質(zhì)量濃度的1/32、1/256 和1/256。由該結(jié)果可知，丟失外膜層使菌體對肉桂醇的敏感程度增加，而進(jìn)一步丟失肽聚糖層未改變菌體對肉桂醇的敏感程度，說明外膜是肉桂醇抑制副溶血性弧菌的主要作用位點。彭志峰等[21]曾對比土霉素和四環(huán)素對鴨源雞桿菌親本株RU 和外膜孔蛋白OmpW突變株ΔOmpW 的MIC，結(jié)果顯示，ΔOmpW 的MIC 值分別降低到RU 的1/8 和1/32，與本試驗結(jié)果一致。以上結(jié)果說明，外膜孔蛋白是外膜層中抑菌劑作用的靶點。

表1 細(xì)胞壁缺失對副溶血性弧菌最小抑菌濃度的影響Table 1 Effects of cell wall deletion on the minimum inhibitory concentration of V.parahaemolyticus

2.2 細(xì)胞壁缺失對副溶血性弧菌細(xì)胞膜完整性的影響

核酸和蛋白質(zhì)均是菌體重要的單位結(jié)構(gòu)物質(zhì)，在核酸和蛋白質(zhì)的特征吸收波長處菌液吸光度值增大時，說明二者發(fā)生了外滲，表明細(xì)胞膜完整性遭受破壞[22]。從表2中可以看出，通過不同質(zhì)量濃度的肉桂醇處理后，3 組副溶血性弧菌的細(xì)胞膜均受到不同程度的破壞，并且隨著肉桂醇質(zhì)量濃度的增加，受到的破壞也越大，說明肉桂醇會作用于細(xì)菌細(xì)胞膜。當(dāng)肉桂醇質(zhì)量濃度低至1/4 MIC 時，對3 組副溶血性弧菌的抑制作用已經(jīng)減弱，與空白組的細(xì)胞膜受損程度相近。相較于UG，OMDG 和CWDG 菌液中特征性吸光度值無顯著差異（P＜0.05），表明進(jìn)一步的去除肽聚糖層對細(xì)胞膜的完整性無影響，即細(xì)胞壁中外膜層是菌體抵抗抑菌劑的主要結(jié)構(gòu)，對細(xì)胞膜的損傷有保護(hù)作用。

表2 細(xì)胞壁缺失對副溶血性弧菌細(xì)胞膜完整性的影響Table 2 Effects of cell wall deletion on cell membrane integrity of V.parahaemolyticus

2.3 內(nèi)膜通透性對肉桂醇抑菌性能的影響

硫酸粘桿菌素是一種窄譜抗生素，對革蘭氏陰性菌有很強(qiáng)的抑菌作用。它先與外膜層中的脂多糖結(jié)合，破壞外膜通透性，進(jìn)而與細(xì)胞膜上脂蛋白結(jié)合，使細(xì)胞膜的通透性增加、表面張力降低，導(dǎo)致胞內(nèi)的重要物質(zhì)外滲，嚴(yán)重時引起菌體死亡[23]。由表3可知，在UG 中，肉桂醇質(zhì)量濃度越低，菌體受到的破壞越小，內(nèi)容物滲出越少，OD 值就越??；在OMDG 和CWDG 中，由于外膜層已被去除，細(xì)胞膜被硫酸粘桿菌素破壞，導(dǎo)致加入的肉桂醇已經(jīng)沒有可以作用的部位，因此肉桂醇質(zhì)量濃度的變化對結(jié)果無影響，故肉桂醇可能對外膜和細(xì)胞膜都有作用。

表3 內(nèi)膜通透性對肉桂醇抑菌性能的影響Table 3 Effects of inner membrane permeability on antibacterial property of cinnamyl alcohol

2.4 外膜蛋白SDS-PAGE

將從試驗菌株副溶血性弧菌ATCC17802 中提取的外膜蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 試驗，結(jié)果見圖3。共獲得10 條蛋白條帶，其分子質(zhì)量大小在18.4～66.2 ku 之間，與之前文獻(xiàn)報道的副溶血性弧菌外膜蛋白分子量范圍相符[24]。

圖2 副溶血性弧菌外膜蛋白SDS-PAGE 圖譜Fig.2 SDS-PAGE electrophoretogram of outer membrane proteins of V.parahemolyticus

2.5 外膜蛋白競爭試驗

競爭試驗主要是用來判斷肉桂醇的作用位點是否為外膜層中的外膜蛋白。由圖1計算出提取的外膜蛋白樣品的質(zhì)量濃度為512 μg/mL，滿足競爭試驗中對外膜蛋白的濃度要求。將副溶血性弧菌的外膜蛋白與1/2 MIC 肉桂醇互混1 h 后再與菌體細(xì)胞共培養(yǎng)，外膜蛋白以劑量依賴方式減小肉桂醇對菌體細(xì)胞的損傷作用（圖3），這說明肉桂醇能與外膜蛋白產(chǎn)生相互作用，故菌體無法被PI 染色，凋亡圖中總凋亡率隨外膜蛋白質(zhì)量濃度的增大而降低。

圖3 副溶血性弧菌凋亡圖Fig.3 Apoptosis diagram of V.parahaemolyticus

2.6 細(xì)胞壁缺失對副溶血性弧菌藥物敏感性的影響

細(xì)胞壁缺失對副溶血性弧菌藥物敏感性的影響見表4?？股卦谝志^程中作用的靶點不盡相同，四環(huán)素和紅霉素能抑制蛋白質(zhì)的合成，萬古霉素能抑制細(xì)胞壁的合成，環(huán)丙沙星能抑制DNA的合成和復(fù)制，利福平能抑制RNA 的合成[25]。所測抗生素對UG 均有效，作用于細(xì)胞壁的萬古霉素對OMDG 和CWDG 無效，說明處理的菌體缺失了其作用靶點。然而，利福平在接觸OMDG 細(xì)胞時藥效下降，這可能是因為外膜尤其是外膜蛋白是利福平進(jìn)入菌體的通道，而在接觸CWDG 細(xì)胞時藥效丟失，可能肽聚糖層也在該藥進(jìn)入細(xì)胞過程中起到一定作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

表4 細(xì)胞壁缺失對副溶血性弧菌藥物敏感性的影響（mm）Table 4 Effects of cell wall deletion on drug sensitivity of V.parahaemolyticus（mm）

3 結(jié)論

結(jié)果表明，肉桂醇對各種狀態(tài)的副溶血性弧菌均有抑菌作用。在此基礎(chǔ)上初步研究了肉桂醇對副溶血性弧菌的作用靶點，發(fā)現(xiàn)肉桂醇首先作用于外膜蛋白，之后引起細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外滲，從而使副溶血性弧菌的生長受到抑制。細(xì)胞壁尤其是外膜對于革蘭氏陰性菌的生存至關(guān)重要，可以阻斷多種有害物質(zhì)進(jìn)入菌體。當(dāng)環(huán)境中外膜蛋白的濃度降低時，副溶血性弧菌對肉桂醇的抗性降低，外膜蛋白可以作為抑菌劑開發(fā)的新靶點。