劉雪飛，吳思楠，李秀霞，謝 晶，牟偉麗，郭曉華，李學(xué)鵬*，勵(lì)建榮

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州121013 2 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海201306 3 蓬萊京魯漁業(yè)有限公司 山東煙臺(tái)265600 4 山東美佳集團(tuán)有限公司 山東日照276800）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種嗜鹽性弧菌，屬于革蘭氏陰性短桿菌，該菌大多存在于近海岸的貝類和海水魚類等水產(chǎn)品中，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)在腌漬食品中，是世界上沿海地區(qū)引起食物中毒主要的食源性致病菌之一[1]。據(jù)估計(jì)，每年約有7 600 萬人患病，5 000 人死于食源性疾病，其中很大一部分歸因于沙門氏菌和副溶血性弧菌[2]。副溶血性弧菌最早是在1950年日本的一次由沙丁魚引起的大規(guī)模食物中毒事件中發(fā)現(xiàn)的[3]，之后逐漸在各國的沿海地區(qū)發(fā)現(xiàn)，并持續(xù)至今，已超過沙門氏菌成為世界食源性致病菌之首[4]。其感染途徑主要是食用未完全煮熟的海鮮類食品，進(jìn)而導(dǎo)致急性胃腸炎，甚至?xí)谷怂劳鯷5]。同時(shí)，副溶血性弧菌也是水生動(dòng)物弧菌病爆發(fā)的病原體，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。深入研究副溶血性弧菌的防控技術(shù)，對(duì)促進(jìn)水產(chǎn)品的食用安全和海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有雙重意義。

由于在臨床治療和水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中廣泛使用抗菌劑，副溶血性弧菌中耐藥株的流行日益加劇，50%的臨床和環(huán)境分離株具有耐多藥性[6]。自1968年喹諾酮類藥物問世以來，臨床上一直未引入有效對(duì)抗革蘭氏陰性菌的新型抗生素[7]。細(xì)菌對(duì)現(xiàn)有抗生素已進(jìn)化出多種對(duì)抗機(jī)制，如通過主動(dòng)外排系統(tǒng)增強(qiáng)藥物的外排作用，產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶使藥物失去活性，或?qū)⑺幬镒饔玫陌悬c(diǎn)加以修飾或改變等等[8]，急需尋找具有新的作用位點(diǎn)且安全有效的替代防治策略。

革蘭氏陰性菌之所以很難找到有效的抑制藥物，主要是因?yàn)槠浼?xì)胞的包膜結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，具有雙層膜結(jié)構(gòu)（位于內(nèi)側(cè)的細(xì)胞質(zhì)膜稱為內(nèi)膜，細(xì)胞壁最外層的膜稱為外膜），在兩層膜間為肽聚糖層，與外膜共同構(gòu)成細(xì)胞壁。外膜是革蘭氏陰性菌的特有構(gòu)造，具有典型的不對(duì)稱性磷脂雙層結(jié)構(gòu)，由脂多糖、磷脂和外膜蛋白構(gòu)成。一直以來，細(xì)胞與外界環(huán)境的物質(zhì)交換部位主要關(guān)注的是細(xì)胞質(zhì)膜，近10年間研究人員才開始關(guān)注外膜，尤其是外膜蛋白在物質(zhì)穿膜過程中的作用[9]。外膜蛋白包括連接外膜層與肽聚糖層的脂蛋白（Lipoprotein）和跨外膜的孔蛋白（Porin）。單體孔蛋白由8～22 個(gè)偶數(shù)跨膜鏈以反向平行方式通過相鄰鏈間的氫鍵作用形成β-桶狀結(jié)構(gòu)?？缒ゆ湹臄?shù)量決定孔蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致孔徑的不同[10]?？椎鞍卓梢赃x擇性地吸收各種營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也能阻攔多種有害大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞[11]。在去掉細(xì)胞壁的大腸桿菌原生質(zhì)體中，胞內(nèi)高積累化合物與胞內(nèi)低積累化合物之間的積累差異明顯變小，這一結(jié)果證實(shí)外膜是小分子在革蘭氏陰性菌中化合物積累的主要障礙[7]。吳賢斌等[12]曾將大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW 去除，發(fā)現(xiàn)缺失株對(duì)硫酸新霉素和氨芐青霉素的敏感性明顯增加。與親本株相比，在大腸桿菌孔蛋白OmpF/OmpC 缺失株中觀察到高積累藥物積累量顯著降低，說明小分子穿過外膜主要通過孔蛋白[7]。以上研究結(jié)果均顯示，細(xì)胞壁尤其是外膜對(duì)于革蘭氏陰性菌的生存是必不可少的，而去除細(xì)胞壁或是外膜對(duì)于革蘭氏陰性菌可能是致命的。

肉桂醇是我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中允許使用的食品香料，被證實(shí)對(duì)革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑菌效果[13]。Mazzarrino 等[14]針對(duì)腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌篩選出21 種有抑菌活性的精油，發(fā)現(xiàn)肉桂的抑菌效果是有效的。目前關(guān)于肉桂醇對(duì)副溶血性弧菌的抑制作用及機(jī)理的研究尚未見報(bào)道，本文采用肉桂醇作為抑菌劑探究細(xì)胞壁的缺失對(duì)副溶血性弧菌生物學(xué)特性的影響，明確肉桂醇的作用靶點(diǎn)，為副溶血性弧菌的防控提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基和試劑

副溶血性弧菌（V.parahaemolyticus ATCC17802）保存于-80℃超低溫冰箱中。

3%氯化鈉堿性蛋白胨水（APW）、營養(yǎng)瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。以上培養(yǎng)基均121℃滅菌20 min。

肉桂醇、Tris、EDTA、硫酸粘桿菌素、十二烷基肌氨酸鈉（SLS）、SYBR Green I、PI，生工生物工程（上海）股份有限公司；溶菌酶、馬來酸鹽，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；考馬斯亮藍(lán)G-250，天津市福晨化學(xué)試劑廠；蔗糖、氯化鎂、磷酸二氫鉀、乙醇，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；磷酸、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；常用藥敏試紙，杭州濱和微生物試劑有限公司；牛血清蛋白，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器、設(shè)備

ZD-85A 氣浴恒溫振蕩器，金壇市科析儀器有限公司；真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GI54DS 型自動(dòng)蒸汽壓力滅菌鍋，廈門致徽儀器有限公司；5804R 高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf中國有限公司；Czone5F 自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀，杭州迅數(shù)科技有限公司；perkin elmer v3 酶標(biāo)儀，成都必成豐瑞生物技術(shù)有限公司；UV-2550 紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司；Scientz-IID 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；SDS 電泳系統(tǒng)、Gel Doc XR+凝膠成像儀，美國BIORAD 有限公司；Accuri C6 Plus 流式細(xì)胞儀，BD生物科學(xué)北京卓越中心。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌體活化及原生質(zhì)體制備 將副溶血性弧菌按1%的接種量加入APW 中，37℃、130 r/min培養(yǎng)12 h，連續(xù)培養(yǎng)2 代。

參考Xu 等[15]的方法制備副溶血性弧菌原生質(zhì)體。將活化的菌液置于4℃、6 000 r/min 離心收集菌體細(xì)胞。用0.01 mol/L Tris-Hcl（pH 7.0）洗滌3 次，細(xì)胞重懸于含有0.5 mol/L 蔗糖的0.01 mol/L Tris-Hcl（pH 7.0）中，緩慢加入EDTA 溶液（pH 8.0，20 min 之內(nèi)完成此步）至其終濃度為0.01 mol/L。37℃、100 r/min 振蕩20 min，獲得一組除去外膜層的細(xì)菌細(xì)胞（Outer membrane deficient group，OMDG），留此階段部分菌體冷藏備用。另一部分菌體在4℃、3 000 r/min 離心收集細(xì)胞，用SMM 緩沖劑（20 mmol/L 馬來酸鹽、0.5 mol/L 蔗糖、20 mmol/L MgCl2，pH 6.5）清洗2 次，細(xì)胞重懸于SMM 緩沖劑（含1 mg/mL 溶菌酶）中，37℃、100 r/min 振蕩30 min，除去肽聚糖層，緩慢滴加EDTA溶液（pH 8.0）使其終濃度為0.01 mol/L，放入37℃的培養(yǎng)箱溫育15 min，獲得一組去壁的細(xì)菌細(xì)胞（Cell wall deficient group，CWDG），將此原生質(zhì)體冷藏備用。未處理的菌體（Untreated group，UG）同樣冷藏備用。

1.3.2 最小抑菌濃度測(cè)定 采用二倍稀釋法處理肉桂醇原液（質(zhì)量濃度為1 g/mL），使其質(zhì)量濃度依次為原液的1/2 至1/2048。試管內(nèi)物質(zhì)組成為8.9 mL APW、1 mL 菌液（分別為UG、OMDG 和CWDG）和0.1 mL 不同質(zhì)量濃度的肉桂醇溶液。所有試管置于37℃培養(yǎng)24 h 后觀察菌體生長情況，使培養(yǎng)液保持澄清的最小藥物質(zhì)量濃度即為肉桂醇對(duì)副溶血性弧菌的最小抑菌濃度（MIC）。

1.3.3 細(xì)胞膜完整性測(cè)定 參考張赟彬等[16]的方法，將菌懸液在4℃、3 000 r/min 條件下離心15 min 收集菌體，磷酸緩沖液（pH 7.0）清洗并重懸。向新的離心管中加入10 mL 菌懸液和45 μL 肉桂醇（1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、空白），37℃培養(yǎng)6 h，在6 000 r/min 下離心3 min 收集上清液。在波長260 nm 處測(cè)定其吸光度值，即為菌液中核酸的含量。同時(shí)采用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)上清液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色，測(cè)定其在波長280 nm 處的吸光度值，即為菌液中蛋白質(zhì)的含量。

1.3.4 硫酸粘桿菌素試驗(yàn)參考Richter 等[7]的方法并適當(dāng)修改，先向96 孔板每孔中加入20 μL 硫酸粘桿菌素溶液（6 μmol/L）和178 μL 稀釋好的菌懸液，靜置30 min，再加入不同質(zhì)量濃度的肉桂醇（1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、空白）2 μL，混勻并置于37℃培養(yǎng)18～24 h 后用酶標(biāo)儀測(cè)定其在波長280 nm 處的吸光度值。

1.3.5 外膜蛋白的提取及質(zhì)量濃度測(cè)定 參考Chiu 等[17]的方法進(jìn)行外膜蛋白的提取，并稍作修改。在4 000 r/min、4℃條件下收集細(xì)胞，經(jīng)4℃生理鹽水洗滌3 次，重懸于少量體積的鹽水中，利用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎處理（300 W、冰浴5 min），間歇10 次完成。在5 000 r/min、4℃條件下離心20 min，收集上清；于15 000 r/min 離心40 min，沉淀重懸于2 g/100 mL SLS 中并在室溫條件下孵育1 h 后，于15 000 r/min 離心40 min，沉淀即為外膜蛋白。

利用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford 法）[18]測(cè)定獲得的外膜蛋白質(zhì)量濃度。首先利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。測(cè)定波長595 nm 處外膜蛋白樣品的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算出外膜蛋白的質(zhì)量濃度。

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Bovine serum albumin standard curve

1.3.6 外膜蛋白SDS-PAGE 采用非連續(xù)緩沖系統(tǒng)垂直板電泳，選用12%分離膠，5%濃縮膠。外膜蛋白樣品沸水浴5 min，加樣量為20 μL【16 μL 蛋白溶液+4 μL（5×）蛋白上樣緩沖液】，80 V 電壓進(jìn)行樣品濃縮，樣品進(jìn)入分離膠后加壓至120 V，當(dāng)溴酚藍(lán)即將跑出膠板時(shí)，停止電泳。膠板考馬斯亮藍(lán)染色后置于凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.7 外膜蛋白競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)參考Lam 等[19]的方法進(jìn)行外膜蛋白競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)，并作一定的改動(dòng)。將50 μL 肉桂醇、50 μL 外膜蛋白（質(zhì)量濃度在2～512 μg/mL）加入96 孔板中，37℃下孵育1 h。之后向每孔中加入100 μL 副溶血性弧菌懸液（約2.5×106個(gè)/mL，使肉桂醇終質(zhì)量濃度為1/2 MIC），37℃下孵育2 h。各孔中取出50 μL 混合培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至第2 個(gè)96 孔板中，并加入100 μL 鹽水和染料混合物（即含有0.1% SYBR Green I 和0.1%PI 的鹽水），用流式細(xì)胞儀分析第2 個(gè)96 孔板中的各孔，確定細(xì)胞凋亡情況。

1.3.8 藥敏試驗(yàn) 參考李莉等[20]的方法，向100 mL 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中分別加入500 μL 處理好的菌液（包括UG、OMDG、CWDG），混勻后倒平板，待培養(yǎng)基凝固后向每個(gè)平板中放入3 片相同的藥敏試紙（包括四環(huán)素、紅霉素、萬古霉素、環(huán)丙沙星、利福平），所有平板置于37℃培養(yǎng)18～24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010 并繪制圖表，利用SPSS 19.0 對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，所有試驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3 次，測(cè)定結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞壁缺失對(duì)副溶血性弧菌最小抑菌濃度的影響

在確定肉桂醇對(duì)副溶血性弧菌有抑菌活性基礎(chǔ)之上，采用二倍稀釋法測(cè)定3 組副溶血性弧菌（包括UG、OMDG、CWDG）的MIC，結(jié)果見表1，細(xì)胞壁缺失可以改變副溶血性弧菌對(duì)抑菌劑的敏感性。肉桂醇對(duì)UG、OMDG 和CWDG 的MIC 分別為原液質(zhì)量濃度的1/32、1/256 和1/256。由該結(jié)果可知，丟失外膜層使菌體對(duì)肉桂醇的敏感程度增加，而進(jìn)一步丟失肽聚糖層未改變菌體對(duì)肉桂醇的敏感程度，說明外膜是肉桂醇抑制副溶血性弧菌的主要作用位點(diǎn)。彭志峰等[21]曾對(duì)比土霉素和四環(huán)素對(duì)鴨源雞桿菌親本株RU 和外膜孔蛋白OmpW突變株ΔOmpW 的MIC，結(jié)果顯示，ΔOmpW 的MIC 值分別降低到RU 的1/8 和1/32，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。以上結(jié)果說明，外膜孔蛋白是外膜層中抑菌劑作用的靶點(diǎn)。

表1 細(xì)胞壁缺失對(duì)副溶血性弧菌最小抑菌濃度的影響Table 1 Effects of cell wall deletion on the minimum inhibitory concentration of V.parahaemolyticus

2.2 細(xì)胞壁缺失對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞膜完整性的影響

核酸和蛋白質(zhì)均是菌體重要的單位結(jié)構(gòu)物質(zhì)，在核酸和蛋白質(zhì)的特征吸收波長處菌液吸光度值增大時(shí)，說明二者發(fā)生了外滲，表明細(xì)胞膜完整性遭受破壞[22]。從表2中可以看出，通過不同質(zhì)量濃度的肉桂醇處理后，3 組副溶血性弧菌的細(xì)胞膜均受到不同程度的破壞，并且隨著肉桂醇質(zhì)量濃度的增加，受到的破壞也越大，說明肉桂醇會(huì)作用于細(xì)菌細(xì)胞膜。當(dāng)肉桂醇質(zhì)量濃度低至1/4 MIC 時(shí)，對(duì)3 組副溶血性弧菌的抑制作用已經(jīng)減弱，與空白組的細(xì)胞膜受損程度相近。相較于UG，OMDG 和CWDG 菌液中特征性吸光度值無顯著差異（P＜0.05），表明進(jìn)一步的去除肽聚糖層對(duì)細(xì)胞膜的完整性無影響，即細(xì)胞壁中外膜層是菌體抵抗抑菌劑的主要結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)胞膜的損傷有保護(hù)作用。

表2 細(xì)胞壁缺失對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞膜完整性的影響Table 2 Effects of cell wall deletion on cell membrane integrity of V.parahaemolyticus

2.3 內(nèi)膜通透性對(duì)肉桂醇抑菌性能的影響

硫酸粘桿菌素是一種窄譜抗生素，對(duì)革蘭氏陰性菌有很強(qiáng)的抑菌作用。它先與外膜層中的脂多糖結(jié)合，破壞外膜通透性，進(jìn)而與細(xì)胞膜上脂蛋白結(jié)合，使細(xì)胞膜的通透性增加、表面張力降低，導(dǎo)致胞內(nèi)的重要物質(zhì)外滲，嚴(yán)重時(shí)引起菌體死亡[23]。由表3可知，在UG 中，肉桂醇質(zhì)量濃度越低，菌體受到的破壞越小，內(nèi)容物滲出越少，OD 值就越?。辉贠MDG 和CWDG 中，由于外膜層已被去除，細(xì)胞膜被硫酸粘桿菌素破壞，導(dǎo)致加入的肉桂醇已經(jīng)沒有可以作用的部位，因此肉桂醇質(zhì)量濃度的變化對(duì)結(jié)果無影響，故肉桂醇可能對(duì)外膜和細(xì)胞膜都有作用。

表3 內(nèi)膜通透性對(duì)肉桂醇抑菌性能的影響Table 3 Effects of inner membrane permeability on antibacterial property of cinnamyl alcohol

2.4 外膜蛋白SDS-PAGE

將從試驗(yàn)菌株副溶血性弧菌ATCC17802 中提取的外膜蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 試驗(yàn)，結(jié)果見圖3。共獲得10 條蛋白條帶，其分子質(zhì)量大小在18.4～66.2 ku 之間，與之前文獻(xiàn)報(bào)道的副溶血性弧菌外膜蛋白分子量范圍相符[24]。

圖2 副溶血性弧菌外膜蛋白SDS-PAGE 圖譜Fig.2 SDS-PAGE electrophoretogram of outer membrane proteins of V.parahemolyticus

2.5 外膜蛋白競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)

競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)主要是用來判斷肉桂醇的作用位點(diǎn)是否為外膜層中的外膜蛋白。由圖1計(jì)算出提取的外膜蛋白樣品的質(zhì)量濃度為512 μg/mL，滿足競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中對(duì)外膜蛋白的濃度要求。將副溶血性弧菌的外膜蛋白與1/2 MIC 肉桂醇互混1 h 后再與菌體細(xì)胞共培養(yǎng)，外膜蛋白以劑量依賴方式減小肉桂醇對(duì)菌體細(xì)胞的損傷作用（圖3），這說明肉桂醇能與外膜蛋白產(chǎn)生相互作用，故菌體無法被PI 染色，凋亡圖中總凋亡率隨外膜蛋白質(zhì)量濃度的增大而降低。

圖3 副溶血性弧菌凋亡圖Fig.3 Apoptosis diagram of V.parahaemolyticus

2.6 細(xì)胞壁缺失對(duì)副溶血性弧菌藥物敏感性的影響

細(xì)胞壁缺失對(duì)副溶血性弧菌藥物敏感性的影響見表4。抗生素在抑菌過程中作用的靶點(diǎn)不盡相同，四環(huán)素和紅霉素能抑制蛋白質(zhì)的合成，萬古霉素能抑制細(xì)胞壁的合成，環(huán)丙沙星能抑制DNA的合成和復(fù)制，利福平能抑制RNA 的合成[25]。所測(cè)抗生素對(duì)UG 均有效，作用于細(xì)胞壁的萬古霉素對(duì)OMDG 和CWDG 無效，說明處理的菌體缺失了其作用靶點(diǎn)。然而，利福平在接觸OMDG 細(xì)胞時(shí)藥效下降，這可能是因?yàn)橥饽び绕涫峭饽さ鞍资抢Ｆ竭M(jìn)入菌體的通道，而在接觸CWDG 細(xì)胞時(shí)藥效丟失，可能肽聚糖層也在該藥進(jìn)入細(xì)胞過程中起到一定作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

表4 細(xì)胞壁缺失對(duì)副溶血性弧菌藥物敏感性的影響（mm）Table 4 Effects of cell wall deletion on drug sensitivity of V.parahaemolyticus（mm）

3 結(jié)論

結(jié)果表明，肉桂醇對(duì)各種狀態(tài)的副溶血性弧菌均有抑菌作用。在此基礎(chǔ)上初步研究了肉桂醇對(duì)副溶血性弧菌的作用靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)肉桂醇首先作用于外膜蛋白，之后引起細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外滲，從而使副溶血性弧菌的生長受到抑制。細(xì)胞壁尤其是外膜對(duì)于革蘭氏陰性菌的生存至關(guān)重要，可以阻斷多種有害物質(zhì)進(jìn)入菌體。當(dāng)環(huán)境中外膜蛋白的濃度降低時(shí)，副溶血性弧菌對(duì)肉桂醇的抗性降低，外膜蛋白可以作為抑菌劑開發(fā)的新靶點(diǎn)。