李林森, 朱 超, 趙新穎, 屈 鋒*

(1. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院, “分子醫(yī)學(xué)與生物診療”工業(yè)和信息化部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100081; 2. 北京電子科技職業(yè)學(xué)院, 北京 100176)

2020年1月爆發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)在短時(shí)間內(nèi)迅速蔓延全球,給世界公共衛(wèi)生體系帶來(lái)了前所未有的挑戰(zhàn)[1]。國(guó)際病毒分類委員會(huì)將引發(fā)新冠肺炎的病毒命名為嚴(yán)重性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2),它是一種單股正鏈RNA病毒(β-冠狀病毒屬),早期通過(guò)表面凸起的刺突糖蛋白(S蛋白)結(jié)合受體細(xì)胞的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2),后經(jīng)細(xì)胞內(nèi)2型跨膜絲氨酸蛋白酶裂解ACE2并激活S蛋白來(lái)促進(jìn)病毒吸收,進(jìn)而引起病變[2]。目前,疫情已持續(xù)1年多,全球累計(jì)確診病例超1.18億例,且仍呈增加趨勢(shì)。為了盡快控制疫情,全球科研和臨床醫(yī)護(hù)人員聯(lián)手攻關(guān),從病毒的傳播途徑、感染致病機(jī)制、快速檢測(cè)診斷、疫苗開(kāi)發(fā)等多方面開(kāi)展研究,在短時(shí)間內(nèi)取得了一系列突破進(jìn)展。分離技術(shù)作為生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù),在新型冠狀病毒研究中發(fā)揮了不可替代的作用。其中,以色譜為代表的現(xiàn)代分離技術(shù),在實(shí)現(xiàn)病毒微量蛋白質(zhì)純化的同時(shí)能保持蛋白質(zhì)活性和分子結(jié)構(gòu)完整,適用于發(fā)病機(jī)制、疫苗研發(fā)、臨床治療等研究。而以離心為代表的傳統(tǒng)分離技術(shù),是新型冠狀病毒研究的基礎(chǔ)技術(shù)手段,方法簡(jiǎn)單快捷,可初步分離病毒、細(xì)菌等大顆粒物質(zhì)。

本文以“COVID-19”或“SARA-CoV-2”為關(guān)鍵詞,在ISI Web of Science數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行主題檢索,截至2020年12月31日為止,相關(guān)期刊論文已達(dá)26 160篇,研究方向包括普通內(nèi)科學(xué)、公共環(huán)境衛(wèi)生、傳染病學(xué)、藥理學(xué)、分子生物學(xué)、化學(xué)等(見(jiàn)圖1)。其中,國(guó)際頂級(jí)學(xué)術(shù)期刊Nature,Science和Cell分別發(fā)表新型冠狀病毒相關(guān)論文62、58和43篇,論文中應(yīng)用的分離技術(shù)主要有親和色譜(AC)和尺寸排阻色譜(SEC)、液相色譜、磁珠分離和離心,研究?jī)?nèi)容涉及新型冠狀病毒的傳播、溯源、治療藥物、疫苗研發(fā)、臨床防治和疫情防控等方面。分析化學(xué)類專業(yè)期刊發(fā)表相關(guān)論文有限,代表性期刊AnalyticalChemistry在2020年全年僅發(fā)表14篇新型冠狀病毒研究論文,其中2篇報(bào)道采用微納分離技術(shù)對(duì)病毒進(jìn)行高靈敏檢測(cè)。

圖 1 2020年新型冠狀病毒研究文獻(xiàn)數(shù)量分布Fig. 1 Number distribution of research papers on SARA-CoV-2 in 2020SARS-CoV-2: severe acute respiratory syndrome coronavirus 2.

本文總結(jié)了分離技術(shù)在新型冠狀病毒研究、檢測(cè)和防疫中的應(yīng)用,從親和色譜和尺寸排阻色譜、液相色譜、磁珠分離、離心、微納分離和電泳6個(gè)方面進(jìn)行介紹。

1 AC和SEC

親和色譜和尺寸排阻色譜是Nature,Science和Cell期刊報(bào)道文獻(xiàn)中使用最頻繁的蛋白質(zhì)純化技術(shù)。其中,AC是通過(guò)生物分子與功能配基的特異性作用對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化,是實(shí)驗(yàn)室中生物大分子分離純化最具特異性和高效性的技術(shù),但配基昂貴且偶聯(lián)技術(shù)復(fù)雜,限制了其應(yīng)用;SEC是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量差異對(duì)待測(cè)物中各組分進(jìn)行分離,優(yōu)勢(shì)在于分辨率高,操作簡(jiǎn)單,但對(duì)于樣品純度要求很高,因此常用于親和色譜后蛋白質(zhì)的進(jìn)一步純化。在當(dāng)前新型冠狀病毒研究中,AC與SEC常被用于純化病毒表面S蛋白、ACE2、S蛋白受體結(jié)合域(RBD)等。

1.1 新型冠狀病毒傳播研究

Shang等[3]使用鎳離子金屬螯合親和色譜(Ni-NTA)對(duì)多聚組氨酸標(biāo)簽(His6-tag)標(biāo)記的SARS-CoV-2和SARS-CoV的RBD以及ACE2胞外域分離純化,使用Protein A親和色譜純化重組人APOM蛋白(Fc-tag)標(biāo)記的ACE2,隨后用SEC對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)一步純化。通過(guò)比較分析ACE2對(duì)SARS-CoV-2、SARS-CoV以及蝙蝠冠狀病毒RaTG13的識(shí)別差異,揭示SARS-CoV-2在動(dòng)物和人類之間的潛在傳播。以同樣方法分離純化SARS-CoV-2、SARS-CoV和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)的RBD以及ACE2胞外域后,Shang等[4]對(duì)比分析ACE2與3種病毒RBD的結(jié)合差異,為病毒干擾策略研究提供參考。

1.2 病毒感染機(jī)制研究

Yan等[5]通過(guò)鏈霉親和素突變體(Strep-Tactin)瓊脂糖凝膠和SEC純化了親水性多肽標(biāo)簽(FLAG-tag)標(biāo)記中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(B0AT1)和鏈霉親和素結(jié)合肽標(biāo)簽(Strep-Tag)標(biāo)記ACE2,研究在有無(wú)RBD的情況下,ACE2與B0AT1復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)差異,推動(dòng)病毒感染的分子基礎(chǔ)研究。Hillen等[6]利用組氨酸標(biāo)記(HisTrap)親和色譜柱純化冠狀病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的主要RNA聚合酶(Nsp 12)及其輔助因子Nsp 7和Nsp 8,分析這些蛋白質(zhì)與RNA依賴性聚合酶的結(jié)構(gòu),應(yīng)用于病毒RNA復(fù)制研究。

表 1 親和色譜和尺寸排阻色譜在新型冠狀病毒相關(guān)蛋白純化中的應(yīng)用

1.3 新型冠狀病毒的藥物篩選及疫苗設(shè)計(jì)

Gao等[7]用Ni-NTA親和色譜柱純化了Nsp 12、Nsp 7和Nsp 8,解析了該聚合酶與抗病毒藥物瑞德西韋(remdesivir)的結(jié)合方式。Riva等[8]利用Ni-NTA親和色譜柱對(duì)SARS-CoV-2的木瓜蛋白酶樣蛋白酶(PLpro)和主蛋白酶(Mpro)進(jìn)行純化,從約12 000個(gè)臨床階段的小分子藥物中篩選出13種具有治療效果的小分子抑制劑。Yuan研究組[9]將Protein G親和柱用于患者體內(nèi)SARS-CoV特異性人類單克隆抗體(CR3022)的純化,研究發(fā)現(xiàn)CR3022可有效結(jié)合SARS-CoV-2的RBD蛋白,是一種潛在的抗病毒藥物。Ju等[10]使用Protein A親和柱對(duì)SARS-CoV-2感染者B細(xì)胞中RBD特異性單克隆抗體進(jìn)行純化,從206種純化的單克隆抗體中發(fā)現(xiàn)抗SARS-CoV-2中和活性抗體,且該抗體基本不結(jié)合SARS-CoV和MERS-CoV。

表1統(tǒng)計(jì)了上述AC和SEC純化的多種新型冠狀病毒相關(guān)蛋白質(zhì),并列舉了純化使用的蛋白標(biāo)簽。

2 液相色譜

高效液相色譜(HPLC)具有高效、快速、靈敏度高、重復(fù)性好等特點(diǎn),是化合物純度鑒定和生物大分子分析的通用分析方法。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)在保留色譜技術(shù)高效分離優(yōu)勢(shì)的同時(shí),通過(guò)MS獲得待測(cè)組分豐富的結(jié)構(gòu)信息,在藥物代謝、復(fù)雜基質(zhì)單一成分鑒定、代謝組學(xué)研究等方面凸顯優(yōu)勢(shì)[17]。

2.1 新型冠狀病毒候選藥物評(píng)估

Zhang等[18]報(bào)告了冠狀病毒藥物靶標(biāo)Mpro與α-酮酰胺抑制劑復(fù)合物的X射線結(jié)構(gòu),通過(guò)LC-MS/MS分析確定α-酮酰胺抑制劑13a和13b具有明顯的肺向性。Jin等[19]利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)篩選Mpro抑制劑,測(cè)定了10 000多種藥物或活性化合物,并利用LC-MS/MS分析確定依布硒啉、PX-12和卡莫呋對(duì)Mpro的共價(jià)結(jié)合。Ma等[20]將非變性質(zhì)譜(native MS)用于Mpro與4種潛在抑制劑(波普瑞韋、GC-376以及鈣蛋白酶抑制劑II和XII)的結(jié)合表征,結(jié)果發(fā)現(xiàn)此4種化合物均能明顯抑制SARS-CoV-2在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。Maisonnasse等[21]基于LC-MS/MS研究了羥氯喹(HCQ)在體外和SARS-CoV-2感染獼猴中的抗病毒活性,通過(guò)定量分析血清、血液以及肺組織中HCQ含量,發(fā)現(xiàn)HCQ沒(méi)有明顯的預(yù)防感染能力。

2.2 復(fù)雜基質(zhì)單一成分鑒定

Dai研究組[22]針對(duì)SARS-CoV-2主要蛋白酶Mpro設(shè)計(jì)合成了兩種先導(dǎo)化合物11a和11b,通過(guò)HPLC鑒定其純度,分別為99.88%和99.20%,這兩種化合物在體內(nèi)均表現(xiàn)出有效的抗SARS-CoV-2感染活性,可作為候選藥物用于后續(xù)臨床研究。Monteil等[23]使用HPLC鑒定了鼠源重組ACE2,并比較了鼠源重組與人重組ACE2在SARS-CoV-2抗感染方面的差異。結(jié)果表明,人重組ACE2可顯著降低細(xì)胞和多種人體器官模型的病毒感染,而鼠源重組ACE2則沒(méi)有此效果。在對(duì)患病程度不同的新冠病人及健康人員血清進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析后,Shen等[24]利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)從血清中分離鑒定并定量了894種蛋白質(zhì)和941種代謝物(包括36種藥物及其代謝物),揭示了重癥患者血清中特征蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物的變化,為疾病嚴(yán)重程度評(píng)估提供參考。

3 磁珠分離

磁珠分離技術(shù)可通過(guò)磁性顆粒表面修飾的官能團(tuán)或特異性抗體,從復(fù)雜基質(zhì)中選擇性結(jié)合靶標(biāo)分子,并在外磁場(chǎng)輔助下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物富集,其分離效率高、重復(fù)性好,但提取效率低且價(jià)格較高。當(dāng)前,磁珠分離技術(shù)仍是新型冠狀病毒分離的主要方法,且有多款基于磁微粒-化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)試劑盒通過(guò)國(guó)家藥監(jiān)局審批。該試劑盒采用雙抗原夾心原理,形成化學(xué)發(fā)光劑/抗原-抗體-磁顆粒/抗原復(fù)合物,在磁場(chǎng)輔助下分離結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物,隨后加入發(fā)光促進(jìn)劑進(jìn)行發(fā)光反應(yīng),通過(guò)對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的檢測(cè)進(jìn)行定量或定性分析。磁珠分離技術(shù)還能與病毒核酸自動(dòng)化提取設(shè)備配套使用,對(duì)大批量樣本的核酸進(jìn)行提取,方法操作簡(jiǎn)單,極大節(jié)約了時(shí)間和人工成本,可顯著提高核酸的檢測(cè)效率[25]。

在新型冠狀病毒研究中,磁珠分離技術(shù)主要應(yīng)用于細(xì)胞分離、核酸提取和免疫學(xué)檢測(cè)。Cao等[14]利用免疫磁珠從外周血單核細(xì)胞(PBMC)中負(fù)選分離到B細(xì)胞,并用結(jié)合腫瘤壞死因子受體超家族7(CD27)抗體的磁珠進(jìn)一步分離得到CD27+記憶B細(xì)胞,通過(guò)高通量單B細(xì)胞測(cè)序?qū)π鹿诳祻?fù)期患者體內(nèi)中和抗體進(jìn)行鑒定。Zhao等[26]在磁性納米顆粒上涂覆了一層聚(氨基酯)-羧基,利用核酸與羧基之間強(qiáng)相互作用提取SARS-CoV-2的RNA。該方法將病毒遺傳物質(zhì)裂解、提取和結(jié)合步驟組合到一起,得到的納米顆粒-RNA復(fù)合物不需要額外洗脫即可引入后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR),極大提高COVID-19的診斷效率。Fabiani研究組[27]以磁珠為免疫載體,堿性磷酸酶為免疫標(biāo)記二抗,開(kāi)發(fā)了一種唾液中SARS-CoV-2快速檢測(cè)的電化學(xué)免疫分析法。所建方法可用于唾液臨床樣本中S蛋白和核衣殼蛋白(N蛋白)的檢測(cè),檢出限分別為19 ng/mL和8 ng/mL。

4 離心

離心技術(shù)操作簡(jiǎn)易,成本較低,是通過(guò)控制離心機(jī)轉(zhuǎn)速實(shí)現(xiàn)樣品中蛋白質(zhì)、核酸及細(xì)胞亞組分的分離。作為最基礎(chǔ)的分離技術(shù),離心技術(shù)在新型冠狀病毒檢測(cè)中可用來(lái)分離血漿中的血清,用于抗體和抗原的檢測(cè)。在新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室研究環(huán)節(jié),通過(guò)離心技術(shù)可分離鼻咽拭子中顆粒物質(zhì)以及未消化的死細(xì)胞和纖維碎片,并反復(fù)離心清洗來(lái)沉淀純化病毒核酸。相比于普通離心技術(shù),超速離心技術(shù)具有更強(qiáng)的離心力場(chǎng),可迅速實(shí)現(xiàn)小顆粒(如病毒顆粒、蛋白質(zhì)等)的沉降分離。Bao等[28]使用超速離心從Vero E6病變細(xì)胞中沉淀獲得病毒顆粒,研究了SARS-CoV-2在表達(dá)人ACE2轉(zhuǎn)基因小鼠中的致病性。Zost等[29]將超速離心用于S蛋白假型慢病毒的分離,來(lái)測(cè)定兩種單克隆抗體的中和能力,結(jié)果顯示假病毒比野生型病毒具有更敏感的中和表型,證明在單克隆抗體效果測(cè)定中使用活病毒的必要性。此外,聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-hypaque)密度梯度離心技術(shù)也被用于分離PBMC,以研究普通冠狀病毒和SARS-CoV-2的免疫學(xué)差異[30]。

5 微納分離

材料科學(xué)和電子技術(shù)的進(jìn)步帶動(dòng)了微納分離技術(shù)發(fā)展,使其成為生物樣品分析的重要技術(shù)手段。微流控技術(shù)具有微型尺寸、樣品量小、快速擴(kuò)散、比表面積大等優(yōu)勢(shì),常與其他技術(shù)結(jié)合,用于SARS-CoV-2相關(guān)蛋白質(zhì)的高靈敏檢測(cè)。Lin等[31]開(kāi)發(fā)了一種微流控免疫芯片,結(jié)合自制熒光檢測(cè)器分析檢測(cè)了SARS-CoV-2 3種生物標(biāo)志物(IgG、IgM和抗原)。該方法快速、靈敏、便捷,在15 min內(nèi)即可完成SARS-CoV-2檢測(cè)。Xiong研究組[32]基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP),開(kāi)發(fā)了一種便攜式LAMP-微流控集成系統(tǒng),該系統(tǒng)使用小型圓盤狀微流控芯片(81 mm),可在40 min內(nèi)同時(shí)識(shí)別7種已知人類冠狀病毒。Funari等[33]將電沉積方法用于一種光微流體傳感平臺(tái)開(kāi)發(fā),通過(guò)比較金納米釘在抗原-抗體結(jié)合時(shí)局部折射率變化,在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)1 μL血清樣品中SARS-CoV-2 S蛋白特異性抗體測(cè)定,檢出限低至0.08 μg/L(～ 0.5 pmol/L)。Tan研究組[34]提出了一種便攜式化學(xué)發(fā)光微流體的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)技術(shù),從候選蛋白質(zhì)中篩選出對(duì)SARS-CoV-2 S1蛋白具有高親和力和特異性的D006作為校準(zhǔn)抗體,在15 min內(nèi)可對(duì)血清中低至2 ng/mL的S1特異性IgG進(jìn)行定量評(píng)估。此技術(shù)還被用于S1和N蛋白的高靈敏檢測(cè)(40 min),檢出限分別為4 pg/mL和62 pg/mL。Lakshmanan等[35]將微流控芯片技術(shù)用于體外抗凝治療的止血效果評(píng)估,設(shè)計(jì)了一種具有兩條正交通道的微流控裝置,其中一條通道作為血管模型,另一條通道用來(lái)模擬損傷部位止血塞的形成,用于識(shí)別潛在的抗凝靶點(diǎn)和試驗(yàn)藥物,以此減輕COVID-19相關(guān)的血栓并發(fā)癥。

6 電泳

電泳技術(shù)利用帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)速率不同而達(dá)到分離的技術(shù),是生命分析領(lǐng)域重要分離手段之一。然而,在新型冠狀病毒研究中電泳的許多應(yīng)用均可被分子生物學(xué)方法替代,且在實(shí)際檢測(cè)中相比于自動(dòng)化設(shè)備和商品化試劑盒,其技術(shù)要求高,因而應(yīng)用有限,亟待后續(xù)研究拓展[36]。其中,瓊脂糖凝膠電泳(AGE)是應(yīng)用較多的電泳技術(shù),常被用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物分析。Kim等[37]對(duì)SARS-CoV-2的RNA基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析,并用AGE方法驗(yàn)證了測(cè)序發(fā)現(xiàn)的亞基因組RNA(sgRNAs),進(jìn)而揭示基因在RNA基因組上的確切位置。Meza-Robles等[38]提出一步嵌套式RT-PCR,不需要實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀,通過(guò)AGE即可實(shí)現(xiàn)新型冠狀病毒的定量檢測(cè)。該技術(shù)使用4個(gè)物種特異性的診斷引物,可同時(shí)實(shí)現(xiàn)特定區(qū)域擴(kuò)增和陽(yáng)性對(duì)照。Si等[39]對(duì)2 188例疑似COVID-19患者的鼻咽拭子樣本進(jìn)行分析,使用RT-PCR檢測(cè)SARS-CoV-2, PCR片段分析結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)12種病毒,以研究SARS-CoV-2和常見(jiàn)呼吸道病毒的流行病學(xué)規(guī)律,以此提高疑似COVID-19患者的診斷效率。

7 結(jié)論

新型冠狀病毒研究已取得一定進(jìn)展,分離技術(shù)在其中發(fā)揮著重要作用。其中,AC和SEC廣泛用于病毒相關(guān)蛋白質(zhì)純化中;精密儀器制造業(yè)的發(fā)展,促使HPLC分離效率的提升,是完成高靈敏度、快速解決病毒代謝組學(xué)分析的關(guān)鍵手段;新材料和電子技術(shù)的進(jìn)步,帶動(dòng)磁珠和微納分離技術(shù)的靈敏度提升和應(yīng)用范圍拓展,尤其是對(duì)化學(xué)試劑消耗降低,實(shí)現(xiàn)了對(duì)環(huán)境的友好,是解決細(xì)胞分析、核酸分離和免疫學(xué)檢測(cè)的首選技術(shù);傳統(tǒng)的離心技術(shù)在病毒顆粒和細(xì)胞分離中發(fā)揮著不可替代的作用;電泳技術(shù)主要用于PCR產(chǎn)物分析。

當(dāng)前,新型冠狀病毒檢測(cè)的難點(diǎn)主要集中在“假陽(yáng)性”和“假陰性”結(jié)果上。作為新型冠狀病毒檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,核酸檢測(cè)能檢測(cè)出處于窗口期的患者,但病毒載量差異、樣品采集、診斷試劑質(zhì)量、實(shí)驗(yàn)操作等問(wèn)題會(huì)導(dǎo)致“假陰性”結(jié)果;抗體檢測(cè)操作簡(jiǎn)單快捷,可作為核酸檢測(cè)假陰性的有效補(bǔ)充,但其對(duì)靈敏度和特異性要求高,靈敏度低會(huì)產(chǎn)生“假陰性”結(jié)果,特異性低則會(huì)產(chǎn)生“假陽(yáng)性”結(jié)果。分離技術(shù)作為新型冠狀病毒檢測(cè)的關(guān)鍵技術(shù),可分離純化復(fù)雜基質(zhì)中病毒顆粒、核酸和蛋白質(zhì),減少基質(zhì)中干擾物質(zhì)帶來(lái)的“假陽(yáng)性”結(jié)果;同時(shí),分離技術(shù)與新型檢測(cè)技術(shù)結(jié)合,可進(jìn)一步提高病毒相關(guān)蛋白質(zhì)檢測(cè)的靈敏性和特異性,確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

綜上所述,分離技術(shù)在新型冠狀病毒研究和防疫檢測(cè)中應(yīng)用廣泛。這些分離技術(shù)各具特色,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選用合適的分離技術(shù),靈活組合,能有效推動(dòng)新型冠狀病毒檢測(cè)、疫苗和創(chuàng)新療法的研發(fā),使疫情早日得到控制。