黃永鵬, 唐 慧, 宋云揚(yáng), 陳 博, 鐘 輝

(國(guó)民核生化災(zāi)害防護(hù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102205)

維庫(kù)溴銨(vecuronium bromide)、羅庫(kù)溴銨(rocuronium bromide)和泮庫(kù)溴銨(pancuronium bromide)是甾類非去極化肌松劑,與其他非去極化肌松劑相比,具有起效作用快、作用時(shí)間長(zhǎng)、體內(nèi)無(wú)積聚、安全性高等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于氣管插管和外科手術(shù)中[1-4]。但在使用過(guò)程中,該類肌肉松弛劑可引起紅斑疹、惡心、嘔吐、頭暈等過(guò)敏反應(yīng)，甚至死亡[5-8],建立快速定量分析該類肌松劑的方法，對(duì)臨床診斷、產(chǎn)品質(zhì)量控制和安全用藥等均有重要應(yīng)用價(jià)值。

維庫(kù)溴銨、羅庫(kù)溴銨和泮庫(kù)溴銨均是季銨鹽結(jié)構(gòu),為強(qiáng)極性水溶性化合物,在反相色譜柱上難以保留,多采用離子對(duì)色譜法進(jìn)行分離。目前,檢測(cè)季銨鹽類肌松劑的方法主要有液相色譜法(HPLC)[9-15]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[16-21]和毛細(xì)管電泳法(CZE)[20,21]等。其中,HPLC不適于痕量檢測(cè),其流動(dòng)相主要為離子對(duì)試劑,流動(dòng)相組成相對(duì)復(fù)雜,不同文獻(xiàn)報(bào)道的流動(dòng)相組成也有所不同。離子對(duì)試劑有離子抑制作用,會(huì)降低質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度,無(wú)法將應(yīng)用于HPLC的流動(dòng)相直接應(yīng)用于LC-MS/MS。已報(bào)道的檢測(cè)肌松劑的LC-MS/MS也存在一些不足,如加標(biāo)回收率范圍較寬[22]、檢出限較高[23]、測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)[24]等。

本文采用HPLC-MS/MS對(duì)血液中3種季銨鹽類肌松劑進(jìn)行了定量分析。血液樣品經(jīng)稀釋、離心和固相萃取柱凈化,經(jīng)色譜柱分離后進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)。該方法前處理簡(jiǎn)便,測(cè)定時(shí)間短,檢出限低,回收率較好,能夠滿足血液樣品中3種季銨鹽類肌松劑同時(shí)檢測(cè)的要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1200-6410 Triple Quad高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、0.45 μm微孔濾膜(美國(guó)Agilent公司); Bond Elut AL-N固相萃取柱(60 mg,美國(guó)Varian公司); XP105天平(上海Mettler-Toledo公司)。

乙腈(HPLC級(jí),德國(guó)Merk KGaA公司);甲酸、三氟乙酸和乙酸銨(分析純,上海Macklin Biochemical公司);維庫(kù)溴銨、羅庫(kù)溴銨和泮庫(kù)溴銨(純度均>95%,北京百靈威科技有限公司);實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:分別準(zhǔn)確稱取適量的維庫(kù)溴銨、羅庫(kù)溴銨和泮庫(kù)溴銨樣品,用乙腈溶解并定容,配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,室溫避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:分別取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量,用乙腈定容至10 mL,配制成已知濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,室溫避光保存。

1.3 樣品前處理

取血液樣品0.5 mL,加入甲酸-水-乙腈(2∶48∶50, v/v/v)溶液4 mL,振蕩均勻,以5 000 r/min離心30 min,取上清液過(guò)Bond Elut AL-N固相萃取柱(先用3 mL甲酸-水-乙腈(2∶48∶50, v/v/v)溶液活化),精密吸取3 mL甲酸-水-乙腈(2∶48∶50, v/v/v)洗脫目標(biāo)物,并用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾,待用。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:ZIC-cHILIC柱(50 mm×2.1 mm, 3.0 μm,德國(guó)Merck KGaA公司);柱溫:30 ℃;流動(dòng)相A:乙腈;流動(dòng)相B: 0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序:0～0.8 min, 70%A; 0.8～0.9 min, 70%A～50%A; 0.9～1.3 min, 50%A～40%A; 1.3～1.4 min, 40%A; 1.4～1.8 min, 40%A～10%A; 1.8～1.9 min, 10%A～70%A; 1.9～3.0 min, 70%A。進(jìn)樣量5 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

電噴霧電離(ESI)源,正離子掃描模式;毛細(xì)管電壓4 000 V;脫溶劑氣溫度300 ℃;脫溶劑氣流量8 L/min;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。各待測(cè)物的定性及定量離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量等參數(shù)見表1。

表 1 3種肌松劑的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

取1.0 μg/mL 3種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別以自動(dòng)進(jìn)樣的方式在ESI+模式下進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化,3種目標(biāo)物全掃描質(zhì)譜圖見圖1。結(jié)果表明,單電荷離子結(jié)構(gòu)的維庫(kù)溴銨和羅庫(kù)溴銨均會(huì)產(chǎn)生[M-Br-]+和[M-Br-+H]2+,其m/z分別為557.4、279.2和529.4、265.2,雙電荷離子結(jié)構(gòu)的泮庫(kù)溴銨則產(chǎn)生m/z為286.6的[M-2Br-]2+。最優(yōu)錐孔電壓下,維庫(kù)溴銨和羅庫(kù)溴銨[M-Br-+H]2+的豐度均高于[M-Br-]+的豐度,故選用維庫(kù)溴銨和羅庫(kù)溴銨[M-Br-+H]2+、泮庫(kù)溴銨[M-2Br-]2+為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜條件優(yōu)化。通過(guò)子離子掃描得到目標(biāo)物碎片離子信息,并對(duì)碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化,每個(gè)目標(biāo)物以響應(yīng)最高的分子離子對(duì)作為定量離子對(duì)，響應(yīng)次高的分子離子對(duì)作為定性離子對(duì)(見表1)。

圖 1 3種肌松劑的全掃描質(zhì)譜圖Fig. 1 Full scan mass spectra of the three muscle relaxants

2.2 色譜條件優(yōu)化

由于維庫(kù)溴銨、羅庫(kù)溴銨和泮庫(kù)溴銨均為季銨鹽類化合物,色譜柱類型和流動(dòng)相組成均會(huì)對(duì)其保留時(shí)間、色譜峰形以及離子化效率產(chǎn)生影響,并最終影響目標(biāo)物的檢測(cè)靈敏度。

實(shí)驗(yàn)在保持3個(gè)目標(biāo)物濃度、流速、進(jìn)樣量等參數(shù)一致,且流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液(80∶20, v/v)的條件下,分別考察了美國(guó)Agilent公司的SB-C8(50 mm×4.6 mm, 1.8 μm)、SB-C18(50 mm×4.6 mm, 1.8 μm)、ZORBAX HILIC Plus(50 mm×2.1 mm, 3.5 μm)和德國(guó)Merck KGaA公司的ZIC-HILIC(50 mm×2.1 mm, 3.0 μm,)、ZIC-cHILIC(50 mm×2.1 mm, 3.0 μm)等5種色譜柱對(duì)目標(biāo)物色譜峰形、離子化效率和保留時(shí)間的影響(見圖2)。結(jié)果表明,采用SB-C8和SB-C18色譜柱時(shí),20 min內(nèi)沒有出現(xiàn)目標(biāo)物色譜峰,這是由于3種帶正電荷的肌松劑極易被硅膠基色譜柱上殘留的硅羥基吸附,需在流動(dòng)相中加入較高濃度的緩沖鹽或離子對(duì)試劑才能減少吸附作用,而高濃度的緩沖鹽和離子對(duì)試劑對(duì)質(zhì)譜信號(hào)有抑制作用,且會(huì)對(duì)質(zhì)譜系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響[25];采用ZORBAX HILIC Plus色譜柱時(shí),雖然色譜峰對(duì)稱性較好,但目標(biāo)物的色譜峰豐度均較低,不利于提高檢測(cè)靈敏度;采用ZIC-HILIC和ZIC-cHILIC色譜柱時(shí),色譜峰均有較好的對(duì)稱性,但在ZIC-cHILIC柱上的色譜峰豐度更高,保留效果也更好。因此選用ZIC-cHILIC為實(shí)驗(yàn)色譜柱。

圖 2 不同色譜柱上3種肌松劑的提取離子流色譜圖Fig. 2 Extracted ion current chromatograms of the three muscle relaxants on different chromatographic columns

實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了5 mmol/L乙酸銨水溶液,0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%甲酸水溶液等常用水相對(duì)目標(biāo)物的離子化效率的影響(見圖3)。實(shí)驗(yàn)中保持3個(gè)目標(biāo)物濃度、流速、進(jìn)樣量等參數(shù)一致,流動(dòng)相中的有機(jī)相乙腈的體積分?jǐn)?shù)為80%,色譜柱為ZIC-cHILIC柱。結(jié)果表明,以0.1%甲酸水溶液為水相時(shí),3個(gè)目標(biāo)物的離子化效率和保留效果均優(yōu)于其他2種溶液，故選擇0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相中的水相。

圖 3 采用不同流動(dòng)相時(shí)3種肌松劑的提取離子流色譜圖Fig. 3 Extracted ion current chromatograms of the three muscle relaxants using different mobile phases

實(shí)驗(yàn)以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相,采用優(yōu)化后的梯度洗脫程序,對(duì)3種季銨鹽類肌松劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，由其總離子流色譜圖(見圖4a)可以看出,3種季銨鹽類肌松劑在3 min內(nèi)可較好的分離。

圖 4 (a)3種肌松劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和(b)空白血液樣品的總離子流色譜圖Fig. 4 Total ion current chromatograms of (a) the three muscle relaxants mixed standard solution and (b) blank blood sample

2.3 樣品處理?xiàng)l件的選擇

考察了不同類型的固相萃取柱對(duì)目標(biāo)物的凈化效果,包括OASIS MCX 3cc離子交換固相萃取柱(60 mg,美國(guó)Waters公司)、Carboxylic Acid固相萃取柱(50 mg,美國(guó)J. T. Baker公司)和Bond Elut AL-N固相萃取柱(60 mg,美國(guó)Varian公司)。參照文獻(xiàn)[22]方法，血液樣品先經(jīng)稀釋、離心,然后取上清液過(guò)OASIS MCX 3cc離子交換固相萃取柱,以甲酸-乙腈-水(2∶48∶50, v/v/v)為洗脫劑對(duì)血液樣品進(jìn)行凈化,每次用1 mL洗脫劑進(jìn)行洗脫并進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,5 mL內(nèi)很難將目標(biāo)物完全洗脫,其回收率低于60%;參照上述方法,采用同樣的洗脫劑,使用Carboxylic Acid固相萃取柱對(duì)血液樣品進(jìn)行凈化,結(jié)果顯示,目標(biāo)物與填料結(jié)合作用較強(qiáng),5 mL內(nèi)幾乎沒有目標(biāo)物被洗脫;采用同樣洗脫劑,使用Bond Elut AL-N固相萃取柱凈化時(shí),前2 mL洗脫液中3種目標(biāo)物含量均大于97%,第4 mL洗脫液中無(wú)法檢測(cè)到目標(biāo)物。因此,實(shí)驗(yàn)采用Bond Elut AL-N固相萃取柱,以3 mL的甲酸-乙腈-水(2∶48∶50, v/v/v)為洗脫劑,對(duì)血液樣品進(jìn)行凈化處理。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1專屬性和基質(zhì)效應(yīng)

將0.5 mL空白血液樣品采用1.3節(jié)方法進(jìn)行前處理,然后進(jìn)樣測(cè)定，其總離子流色譜圖見圖4b。結(jié)果表明,空白血液樣品中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)3種目標(biāo)物的測(cè)定不產(chǎn)生干擾,方法專屬性良好。

在空白血液的前處理液中加入3種目標(biāo)物,分別配制50 μg/L和100 μg/L混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)樣分析,得到目標(biāo)物的峰面積(A),同時(shí)測(cè)定相同水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,得到目標(biāo)物的峰面積(B)。根據(jù)公式ME=A/B×100%計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明,空白血液中維庫(kù)溴銨、羅庫(kù)溴銨和泮庫(kù)溴銨的ME值分別為89.5%～94.2%、88.1%～92.8%和90.6%～95.4%,基質(zhì)效應(yīng)較弱,可以使用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

采用1.4節(jié)的儀器條件對(duì)1.2節(jié)配制的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定。以各分析物的峰面積(Y)和對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(X, ng/mL)進(jìn)行線性回歸,得到3種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)(R2),以特征離子色譜峰S/N≥ 3和10時(shí)目標(biāo)物的含量為方法的檢出限和定量限(見表2)。結(jié)果表明,目標(biāo)物在對(duì)應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.996,檢出限為0.2～0.8 ng/mL,定量限為0.5～1.7 ng/mL。

2.4.3加標(biāo)回收率和精密度

在空白血液中分別添加4個(gè)水平(定量限、3倍定量限、200 ng/mL和500 ng/mL)的目標(biāo)物,加標(biāo)樣品按照1.3節(jié)方法處理后進(jìn)行測(cè)定,得到3種目標(biāo)物的平均回收率為92.8%～110.6%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～9.4%(n=6)(見表2)。該方法能夠較好地滿足血液樣品中3種肌松劑含量的測(cè)定要求。

表 2 3種肌松劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)4個(gè)實(shí)際兔子血液樣品進(jìn)行測(cè)試,每個(gè)樣品均采用1.3節(jié)的方法進(jìn)行前處理,結(jié)果表明,樣品中維庫(kù)溴銨、羅庫(kù)溴銨和泮庫(kù)溴銨的含量分別為231～364、173～450和287～428 ng/mL(見表3),均在本方法的線性范圍內(nèi)。

表 3 4個(gè)兔子血液樣品的測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

本文通過(guò)對(duì)色譜柱、流動(dòng)相、質(zhì)譜測(cè)定條件以及血液樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化,建立了HPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定血液中維庫(kù)溴銨、羅庫(kù)溴銨和泮庫(kù)溴銨的分析方法,并應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。該方法前處理簡(jiǎn)便,測(cè)定時(shí)間短,線性范圍寬,檢出限低,靈敏度高,為血液樣品中3種季銨鹽類肌松劑的同時(shí)測(cè)定提供了簡(jiǎn)單、實(shí)用的方法。