劉 燕 彭薪元 丁 潔 夏天嬌 徐力致

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南京 210023)

動物實(shí)驗(yàn)與生物醫(yī)學(xué)進(jìn)程息息相關(guān)，在生命科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展歷程中有著重大的作用。伴隨著人類文明的進(jìn)步，人們也同樣關(guān)注動物生存福利。因此實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)應(yīng)運(yùn)而生，倡導(dǎo)“減少(reduction)、替代(replacement)、優(yōu)化(refinement)”的“3R”原則?？茖W(xué)研究者們依循上述原則，除了在對動物進(jìn)行有創(chuàng)實(shí)驗(yàn)前必須實(shí)施有效麻醉[1]，減輕動物由實(shí)驗(yàn)造成的痛苦外，還注重優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，在確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)有效情況下，盡量減少實(shí)驗(yàn)動物的使用量。我們在研究過程關(guān)注到，直接麻醉取血的小鼠與麻醉后1 h左右(進(jìn)行心電、CT等檢測)再取血的小鼠，其血液循環(huán)中單核細(xì)胞存在顯著性差異?？紤]到麻醉藥對機(jī)體的影響，以及不同麻醉藥藥物作用機(jī)制的不同，本研究觀察了三種常用動物麻醉藥物(氨基甲酸乙酯、水合氯醛和戊巴比妥鈉)對雄性小鼠血糖及血液常規(guī)指標(biāo)的影響，同步觀察了同一麻醉藥隨時間延長(0、15、60 min)而發(fā)生的血常規(guī)變化情況。以期在今后的動物研究中，為選擇恰當(dāng)?shù)穆樽硭幬锾峁椭瑥亩档蜕踔赁鸪樽硭幬飳ρ芯繉ο蠡蜓芯拷Y(jié)果的直接干擾。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

C57BL6雄性成年小鼠24只，體質(zhì)量25～32 g。小鼠購自南京大學(xué)模式動物研究所[SCXK(蘇)2015-0001]，飼養(yǎng)于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動物房。

1.2 儀器和試劑

全自動血液分析儀(邁瑞B(yǎng)C-5500)；血糖分析儀和血糖試紙(強(qiáng)生ONETOUCH Ultra)；氨基甲酸乙酯(化學(xué)純)、水合氯醛(分析純)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；戊巴比妥鈉(分析純)購自生興生物技術(shù)有限公司。藥品均使用0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行配制。

1.3 方法

所有小鼠隨機(jī)分配為三組，每組8只，分別為：20%氨基甲酸乙酯組、2.5%水合氯醛組和1%戊巴比妥鈉組。

小鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，飲水自由。從小鼠尾靜脈取血，測量初始血糖(10 μL血)和血常規(guī)(20 ～ 30 μL血，EDTA抗凝)。腹腔注射麻醉：20%氨基甲酸乙酯組，麻醉劑量為7 mL/kg； 2.5%水合氯醛組，麻醉劑量為3 mL/kg； 1%戊巴比妥鈉組，麻醉劑量為10 mL/kg。小鼠麻醉后15 min及60 min時再各測量一次血糖和血常規(guī)。

血常規(guī)使用全自動血液分析儀檢測。檢測指標(biāo)為白細(xì)胞數(shù)總數(shù)(WBC)、中性粒細(xì)胞數(shù)(Neu)、單核細(xì)胞數(shù)(Mon)、淋巴細(xì)胞數(shù)(Lym)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)(Eos)、嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)(Bas)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞圧積(HCT)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、平均血紅蛋白(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板(PLT)、平均血小板體積(MPV)、血小板分布寬度(PDW)及血小板壓積(PCT)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采取自身對照方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，即同只小鼠的原初數(shù)據(jù)，15 min和60 min采集數(shù)據(jù)比值進(jìn)行比較。

用Prism統(tǒng)計(jì)軟件對各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行處理，組間比較用t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異顯著，視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種麻醉藥物對小鼠血糖的影響

由表1可知， 20%氨基甲酸乙酯組在麻醉15 min和60 min時的血糖值與初始值相比呈遞增式增加，增值比例分別為61.2%(P<0.05)和75.6%(P<0.01)。2.5%水合氯醛組血糖略有增加但不存在組間差異。1%戊巴比妥鈉組在麻醉15 min后的血糖值與初始值相比增加顯著(P<0.01)，在麻醉60 min后的血糖值回降與初始值相比無差異。

表1 三種麻醉藥不同時間的血糖變化Table 1 The blood glucose changes of threeanesthetics at different times

2.2 三種麻醉藥物對小鼠血常規(guī)的影響

在檢測的血常規(guī)指標(biāo)中，我們觀察到白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)隨麻醉時長增加存在顯著性改變，而嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)和嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)無顯著變化，紅細(xì)胞和血小板各項(xiàng)指標(biāo)均無顯著改變。

對比初始值，在麻醉藥處理后15 min和60 min統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，20%氨基甲酸乙酯組小鼠在麻醉后白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)和單核細(xì)胞數(shù)均呈遞增趨勢，且在60 min時呈顯著增多。2.5%水合氯醛組在麻醉后白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)呈遞減，與初始值相比存在顯著差異。1%戊巴比妥鈉組在麻醉60 min后的白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)和單核細(xì)胞數(shù)與初始值相比存在差異(圖1)。

圖1 三種麻醉藥在不同時間點(diǎn)細(xì)胞數(shù)與初始細(xì)胞數(shù)比較占比改變情況注：與初始細(xì)胞數(shù)比較，*P<0.05,**P<0.01Fig.1 Changes in the proportion of the cell numbers of the three anesthetics at differenttime points compared with the initial cell numbersNote: Compared with the initial cell number,*P<0.05,**P<0.01

3 討論

動物實(shí)驗(yàn)中常用的麻醉藥包括吸入性和非吸入性麻醉藥，其中最常用的吸入性麻醉藥包括乙醚、氟烷、甲氧氟烷等，非吸入性麻醉藥常用的有戊巴比妥鈉、水合氯醛、氨基甲酸乙酯等[2]。戊巴比妥鈉常見于動物麻醉實(shí)驗(yàn)，為中時作用的巴比妥類催眠藥，作用時間可維持4～6 h，顯效較快，用作催眠和麻醉前給藥。水合氯醛也是國內(nèi)目前較常用的動物實(shí)驗(yàn)麻醉藥之一，小劑量可鎮(zhèn)靜，中等劑量可催眠，較大劑量有抗驚厥作用，大劑量可引起昏迷和麻醉，抑制延髓呼吸及血管運(yùn)動中樞，導(dǎo)致死亡[3]。氨基甲酸乙酯對中樞的抑制作用比水合氯醛小，對呼吸及血液循環(huán)的影響也不大。在巴比妥類藥物發(fā)現(xiàn)之前，曾廣泛作為實(shí)驗(yàn)動物的麻醉藥，作用快而強(qiáng)。氨基甲酸乙酯對延髓呼吸中樞的抑制作用較弱，為實(shí)驗(yàn)動物比較安全的麻醉藥，麻醉時間維持長[4]。

本研究結(jié)果顯示，氨基甲酸乙酯對小鼠血糖影響明顯，戊巴比妥鈉對血糖有短暫一過性升高，水合氯醛對小鼠血糖無明顯影響。氨基甲酸乙酯的升血糖影響在近幾年的文章中多有報(bào)道，研究指出氨基甲酸乙酯誘發(fā)動物高血糖可能與腎上腺素效應(yīng)、抑制胰島素的降血糖作用有關(guān)[5-6]。另有報(bào)道,氨基甲酸乙酯升高實(shí)驗(yàn)大鼠血糖的作用機(jī)制可能與肝功能損害及胰島素敏感性下降有關(guān)[7]。戊巴比妥鈉對血糖雖有短暫一過性升高，但幅度和維持時間較氨基甲酸乙酯麻醉組都較小，因此其對血糖的影響遠(yuǎn)不如氨基甲酸乙酯顯著。

氨基甲酸乙酯、水合氯醛和戊巴比妥鈉對小鼠白細(xì)胞的影響表現(xiàn)為不同方向。氨基甲酸乙酯組和戊巴比妥鈉組白細(xì)胞總數(shù)及占比均明顯上升，而水合氯醛組呈現(xiàn)下降趨勢。其中，氨基甲酸乙酯和戊巴比妥鈉的影響主要表現(xiàn)在中性粒細(xì)胞數(shù)和單核細(xì)胞數(shù)的明顯增多，而水合氯醛組表現(xiàn)為明顯的淋巴細(xì)胞數(shù)減少。

綜上所述，氨基甲酸乙酯對小鼠血糖改變影響較大，水合氯醛和戊巴比妥鈉對血糖的影響不大，因此在關(guān)注血糖變化的研究中，應(yīng)避免使用氨基甲酸乙酯作為麻醉藥。而三種麻醉藥對于白細(xì)胞總數(shù)均有不同程度的影響，在相關(guān)研究中需進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，以避免藥物造成的干擾。