童 華 王欣路 冉志超 王庭輝 大邊巴

(1.西安市交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，西安 710061)(2.阿里地區(qū)人民醫(yī)院手麻科，阿里 859000)

七氟醚是臨床上常用的一種吸入麻醉藥物。隨著對(duì)七氟醚作用機(jī)制的不斷了解，目前越來越多研究表明其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的同時(shí)，具有神經(jīng)毒性作用，導(dǎo)致患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的認(rèn)知功能障礙[1-2]。腦蛋白水解液(cerebroprotein hydrolysate injection，CHI)是一種神經(jīng)營養(yǎng)藥物，其通過血—腦脊液屏障，能有效促進(jìn)突觸的形成，改善和調(diào)節(jié)神經(jīng)元的代謝，降低各種神經(jīng)毒素和缺血對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損害[3-4]。近年來，CHI被廣泛用于輕度中風(fēng)后和顱腦損傷后認(rèn)知功能障礙的治療中。然而，腦蛋白水解物是否可以改善七氟醚致認(rèn)知功能障礙罕見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探討CHI對(duì)七氟醚致大鼠記憶損傷作用的影響，并初步研究其中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

腦蛋白水解液(H11022185)購自北京賽升藥業(yè)股份有限公司；七氟醚(H20070172)購自恒瑞醫(yī)藥有限公司；大鼠丙二醛(MDA)ELISA檢測試劑盒、大鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA檢測試劑盒購自紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司；兔抗鼠SYT1、Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase3、β-actin多克隆抗體及HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、HE染色試劑盒、Trizol、通用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(M-MLV)、Real time PCR熒光定量試劑盒(SYBR Green I)、BCA試劑盒、蛋白雙染marker、脫脂奶粉、顯影液均購自北京索萊寶有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及處理

SD大鼠購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(滬)2018-0004]，成年雄性，體質(zhì)量300～350 g。飼養(yǎng)溫度18～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，光照周期為12 h/12 h，飼養(yǎng)周期14 d。將32只大鼠隨機(jī)分為七氟醚組、CHI高劑量組、CHI低劑量組和對(duì)照組，每組8只。七氟醚組吸入2%的七氟醚，每天2 h，連續(xù)7 d，CHI高劑量組每天吸入七氟醚之前，尾靜脈注射腦蛋白水解液1 200 μL，CHI低劑量組每天吸入七氟醚之前，尾靜脈注射腦蛋白水解液300 μL。對(duì)照組，每天不吸入七氟醚，尾靜脈注射等量生理鹽水，具體操作參照文獻(xiàn)[5-6]。

1.3 水迷宮實(shí)驗(yàn)記錄各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力

停止吸入七氟醚2 d，采用水迷宮實(shí)驗(yàn)[5]檢測各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。每只動(dòng)物每天訓(xùn)練4次，兩次訓(xùn)練間隔15～20 min，連續(xù)訓(xùn)練5 d。記錄90 s內(nèi)大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間，此時(shí)間即為逃避潛伏期。在訓(xùn)練的第6天，將平臺(tái)撤除，記錄大鼠平臺(tái)停留時(shí)間和通過平臺(tái)的次數(shù)。

1.4 HE染色檢測各組大鼠海馬組織病理學(xué)改變

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，取出海馬組織。各組海馬組織分別用0.9%氯化鈉溶液漂洗、吸干，4%多聚甲醛中進(jìn)行48 h固定，制成5 μm厚連續(xù)切片，脫蠟水化后蘇木素染液染色3～10 min，分化液分化1～5 s，返藍(lán)液返藍(lán)10 s～1 min，伊紅染色30 s～2 min，脫水，透明，封片，鏡下觀察各組大鼠海馬組織病理學(xué)變化。

1.5 ELISA檢測各組大鼠海馬組織中MDA和SOD水平

取各組0.1 g海馬組織，加入4 ℃生理鹽水溶液制成10%組織勻漿，將組織勻漿以2 500 r/min、 4 ℃離心5 min，收集上清，按試劑盒說明書步驟操作，測定各組大鼠海馬組織中MDA和SOD水平。

1.6 TUNEL檢測各組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況

將病理學(xué)步驟中脫蠟水化后切片，滴加20 μg/mL蛋白酶K處理15～30 min，然后加入反應(yīng)混合液進(jìn)行TUNEL反應(yīng)。用抗熒光淬滅封片劑封片后觀察海馬神經(jīng)元凋亡情況。

1.7 RT-qPCR檢測各組大鼠海馬組織中SYT1 mRNA表達(dá)情況

TRIzol抽提各組大鼠海馬組織的RNA，分別按照通用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(M-MLV)說明書合成cDNA，按照Realtime PCR熒光定量試劑盒(SYBR Green I)說明書檢測SYT1 mRNA的表達(dá)。RT-qPCR反應(yīng)體系：5 μL cDNA模板、0.5 μmol/L上/下游引物、10 μL 2×SYBR Green PCR mix、用ddH2O補(bǔ)足20 μL。RT-qPCR反應(yīng)程序，95 ℃預(yù)變性10 min，1個(gè)循環(huán)，95 ℃變性15 s，58 ℃ 退火20 s，72 ℃延伸20 s，45個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)，2-ΔΔCt的方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。SYT1上游引物5′- TCATTCAGGCTGCCGAACTGCC-3′，下游引物：5′-TCAGCACTTTGCAGGTCACGCC-3′；β-actin上游引物：5′-GATTACTGCTCTGCTCCTAGCA -3′，下游引物：5′- GCCACCGATCCACACAGAGT-3′。

1.8 Western blot檢測各組大鼠海馬組織中SYT1、Bax、Bcl-2和cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)情況

各組海馬組織中分別加入RIPA裂解液，冰上裂解20 min，4 ℃、13 000 r/min離心20 min，取上清并采用BCA試劑盒測定蛋白含量。取30 μg蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，用封閉液(5%脫脂奶粉)封閉，分別加入兔抗鼠SYT1(1∶1 000)、Bax(1∶5 000)、Bcl-2(1∶2 000)、cleaved-Caspase3(1∶2 000)、β-actin(1∶10 000)抗體4 ℃過夜，洗滌后，再加入二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h。ECL曝光成像，最后采用Alpha Imager HP 凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腦蛋白水解液對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

與對(duì)照組相比，七氟醚組、CHI高劑量組、CHI低劑量組大鼠逃避潛伏期顯著增加(P<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.05)，平臺(tái)停留時(shí)間顯著縮短(P<0.05)。與七氟醚組相比，CHI高劑量組大鼠逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加(P<0.05)，平臺(tái)停留時(shí)間顯著延長(P<0.05)，而CHI低劑量組大鼠逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)停留時(shí)間與七氟醚組比較均無顯著性差異(P>0.05)，見表1所列。

表1 腦蛋白水解液對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響Table 1 Effect of cerebroprotein hydrolysate injection onlearning and memory ability of rats

2.2 各組大鼠海馬組織病理學(xué)變化

對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)、排列、形態(tài)均正常，七氟醚組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列松散凌亂，邊界不清，細(xì)胞核固縮，出現(xiàn)空泡，著色較深，CHI高劑量組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞較七氟醚組細(xì)胞排列相對(duì)緊密，細(xì)胞核固縮和空泡現(xiàn)象得到改善，而CHI低劑量組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷情況較七氟醚組無明顯改善，如圖1所示。

圖1 各組大鼠海馬組織病理變化(×200)Fig.1 Pathological changes in hippocampusof rats in each group(×200)

2.3 腦蛋白水解液對(duì)大鼠海馬組織MDA和SOD的影響

與對(duì)照組相比，七氟醚組、CHI高劑量組、CHI低劑量組大鼠海馬組織MDA含量顯著增加(P<0.05)，SOD活性顯著下降(P<0.05)；與七氟醚組比，CHI高劑量組大鼠海馬組織MDA含量顯著下降，SOD活性顯著增加(均P<0.05)，而CHI低劑量組大鼠海馬組織MDA含量和SOD活性與七氟醚組比較均無顯著性差異(均P>0.05)，見表2所列。

表2 腦蛋白水解液對(duì)大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響Table 2 Effect of cerebroprotein hydrolysate injectionon oxidative stress in rats

2.4 腦蛋白水解液對(duì)各組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組相比，七氟醚組、CHI高劑量組、CHI低劑量組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率以及Bax、cleaved-Caspase3蛋白顯著升高，Bcl-2蛋白含量顯著下降(均P<0.05)；與七氟醚組比，CHI高劑量組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率以及Bax、cleaved-Caspase3蛋白顯著下降，Bcl-2蛋白含量顯著升高(均P<0.05)，而CHI低劑量組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況無明顯改善(均P>0.05)，如圖2和圖3所示。

圖2 腦蛋白水解液對(duì)各組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響(×200)Fig.2 Effect of cerebroprotein hydrolysate injection onapoptosis of hippocampal neurons in rats(×200)

圖3 腦蛋白水解液對(duì)各組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Fig.3 Effect of cerebroprotein hydrolysate injection onapoptosis related proteins of hippocampal neurons in rats

2.5 腦蛋白水解液對(duì)大鼠海馬組織SYT1表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組相比，七氟醚組、CHI高劑量組、CHI低劑量組大鼠海馬組織SYT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)；與七氟醚組比，CHI高劑量組大鼠海馬神經(jīng)元組織SYTI mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)，CHI低劑量組大鼠海馬神經(jīng)元組織SYTI mRNA和蛋白表達(dá)水平無顯著變化(均P>0.05)，如圖4所示。

圖4 腦蛋白水解液對(duì)各組大鼠海馬組織SYT1表達(dá)水平的影響注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與七氟醚組相比，#P<0.05Fig.4 Effect of cerebroprotein hydrolysate injectionin on expression of syt1 in hippocampus of ratsNote: Compared with the control group,*P<0.05; Compared with the sevoflurane group,#P<0.05

3 討論

近年來麻醉藥物致患者認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)的問題受到廣泛重視。七氟醚作為廣泛應(yīng)用的吸入全身麻醉藥，已被證實(shí)是誘發(fā)乳腺癌患者發(fā)生POCD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[7-8]。因此，七氟醚對(duì)患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用不可忽視。

海馬主要負(fù)責(zé)長時(shí)記憶的存儲(chǔ)轉(zhuǎn)換和定向等功能，在學(xué)習(xí)和記憶方面扮演著重要角色，受損后會(huì)影響學(xué)習(xí)記憶功能。劉勇攀等[5]研究表明，反復(fù)吸入七氟醚可以通過誘導(dǎo)海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡引起大鼠認(rèn)知功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚吸入前預(yù)先給予高劑量CHI可以有效緩解七氟醚誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙。另外，在組織水平觀察到吸入七氟醚前給予高劑量CHI的大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)得到改善，且海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)Bax和cleaved-Caspase3蛋白顯著下降，而Bcl-2蛋白含量顯著升高。由此可知，CHI減輕七氟醚致大鼠記憶障礙可能與減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)。這與Vaghef等[9]研究結(jié)果相似，他們指出CHI通過抑制大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡減輕乙醇誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶損傷。研究表明，吸入七氟醚會(huì)刺激線粒體產(chǎn)生大量的ROS，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)體和蛋白質(zhì)的氧化，從而導(dǎo)致線粒體腫脹，誘發(fā)凋亡因子激活，進(jìn)一步誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元的凋亡[10-11]。譚宇亭等[12]研究表明，白藜蘆醇(RES)對(duì)七氟醚所致新生大鼠腦損傷的治療作用與降低氧化應(yīng)激水平有關(guān)。Sherif等[13]研究表明，CHI參與介導(dǎo)腦組織的氧化應(yīng)激變化。因此，本研究檢測了大鼠海馬組織MDA和SOD水平的變化，結(jié)果表明CHI高劑量組大鼠海馬組織MDA含量顯著下降，SOD活性顯著增加，提示CHI可能通過降低氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)一步減輕七氟醚所致的神經(jīng)損傷。

突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)，在海馬腦區(qū)，增加突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶能力提高的基礎(chǔ)。SYT1屬于Syt家族的一員，可快速結(jié)合Ca2+，對(duì)胞吞、胞吐過程進(jìn)行有效的調(diào)控，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，影響突觸可塑性[14]。Zhang等[15]研究表明，七氟醚通過下調(diào)大鼠海馬區(qū)SYT1表達(dá)，減少突觸數(shù)目、增寬突觸間隙，從而降低突觸傳遞效能，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力損傷。本研究發(fā)現(xiàn)七氟醚吸入前預(yù)先給予高劑量CHI可以有效提高SYTI mRNA和蛋白表達(dá)水平，提示CHI可能通過增加SYT1的表達(dá)改善七氟醚所致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。以上研究結(jié)果與鄧海峰等[16]研究結(jié)果相似，他們指出毛蕊花糖苷可能通過增加Syt1的表達(dá)改善慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激(CUMS)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

本研究初步表明七氟醚吸入前預(yù)先給予高劑量CHI能夠改善七氟醚麻醉導(dǎo)致的大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，其機(jī)制可能與降低氧化應(yīng)激損傷，抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和增加SYT1表達(dá)有關(guān)。