孫明謙 苗 蘭 張 穎 彭 勍 楊會(huì)珍 劉建勛 林 力

(中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，中藥藥理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091)

動(dòng)脈粥樣硬化是一種由多種因素引起的慢性炎癥性疾病，其內(nèi)皮損傷與脂質(zhì)過氧化有關(guān)[1-2]。引發(fā)和加速動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)主要原因是高脂血癥導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥的增加，高脂血癥是目前誘發(fā)心腦血管疾病的重要因素之一[3]。肝臟通過從血清中清除膽固醇和甘油三酯，在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。因此，對肝臟代謝變化的描述對于高脂血癥的分子機(jī)制研究具有重要意義[4]。

鞘脂(sphingolipids)一類含有鞘氨醇骨架的兩性脂，是生物膜中的一類主要脂類，也是細(xì)胞信號傳遞中的一種生物活性脂類介質(zhì)[5]。它能調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存、增殖、凋亡、分化、遷移和免疫反應(yīng)等重要生理過程。越來越多的研究表明，鞘脂在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展中起著重要作用，并導(dǎo)致心血管疾病[6-7]。 在高脂血癥的情況下，肝臟經(jīng)常遭受嚴(yán)重的脂肪堆積、炎癥和氧化應(yīng)激的損害。這些損傷與鞘脂中神經(jīng)鞘磷脂(sphingomyelin,SM)-神經(jīng)酰胺(ceremide,Cer)-鞘糖脂(glycosphingolipids)之間的代謝密切相關(guān)，這一代謝途徑在鞘脂類成分的代謝中占有重要地位，它們之間的相互代謝也與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。神經(jīng)酰胺占據(jù)了這一途徑的中心樞紐，它們是一個(gè)緊密的系統(tǒng)，彼此密切相關(guān)和相互作用。因此，研究這一途徑在動(dòng)脈粥樣硬化早期發(fā)病機(jī)制中的變化具有重要意義[9]。本研究主要針對鞘脂中的神經(jīng)鞘磷脂、神經(jīng)酰胺及葡萄糖神經(jīng)酰胺(glucosyl-ceramide，Glc-cer)建立靶向代謝組學(xué)方法，圍繞這一代謝途徑進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期為動(dòng)脈粥樣硬化的治療找到新的治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

UltiMateTM3000超快速液相色譜、Q ExactiveTM四極桿軌道離子阱質(zhì)譜、Mikro 220R真空離心濃縮儀(ThermoFisher Scientific)；Mix-3000震蕩混勻器(杭州米歐儀器有限公司)； LAbOSPEC T003日立全自動(dòng)生化儀、TG、TC、LDL-C 及 HDL-C測定試劑盒(HITACHI)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Hettich)； BX51顯微鏡(Olympus)。

高脂飼料(10 kg/箱)，A級，購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司；乙腈、異丙醇、甲醇、水和甲酸為高效液相色譜級，購自Fisher Scientific；醋酸銨購自Sigma-Aldrich。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

18只SPF級敘利亞金黃地鼠，雄性，7周齡，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0011，合格證編號11400700209462。金黃地鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后分組，分為正常對照組(n=9)和高脂血癥模型組(n=9)。高脂血癥模型組飼喂高脂飼料6周，正常對照組飼喂常規(guī)飼料。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有金黃地鼠均隔夜禁食不禁水。采血后將肝臟用生理鹽水沖洗，一部分肝臟取出后立即注入液氮，儲(chǔ)存在-80 ℃；另一部分肝臟進(jìn)行固定、HE染色后觀察組織學(xué)變化。血液樣本經(jīng)4 ℃、12 000 r/min，離心10 min，按血液生化指標(biāo)試劑盒的操作說明進(jìn)行相關(guān)生化指標(biāo)檢測。

1.3 樣品處理與液質(zhì)條件

1.3.1樣本處理：稱取適量組織肝臟，研磨后，加1 mL甲醇混勻?；靹蛘鹗?0 min，然后在4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上層溶液100 μL，置于200 μL內(nèi)襯管中，待測。

1.3.2液相條件：流動(dòng)相為A(乙腈∶水=6∶4，0.1%甲酸，10 mmol/L乙酸銨)和B(異丙醇∶乙腈=9∶1，0.1%甲酸,10 mmol/L乙酸銨)；洗脫程序: 20%B；1 min，20%B；11 min，100%B；13 min，100%B；16 min，20%B；停止色譜柱: Waters UPLC HSS T3(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：1.0 μL；柱溫：45 ℃。

1.3.3質(zhì)譜條件：正離子離子源電壓分別為3.7 kV；毛細(xì)管加熱溫度320 ℃；翹氣壓力30 psi，輔助氣壓力10 psi；容積加熱蒸發(fā)溫度300 ℃；翹氣和輔助氣均為氮?dú)?；碰撞氣為氮?dú)?，壓力?.5 m Torr；一級全掃描參數(shù)為：70 000 dpi，自動(dòng)增益控制目標(biāo)為1×106，最大隔離時(shí)間50 ms，質(zhì)荷比掃描范圍50～1 500；液質(zhì)系統(tǒng)由Xcalibur 2.2 SP1.48軟件控制，數(shù)據(jù)采集和靶向代謝物定量處理均由該軟件操作。

1.4 數(shù)據(jù)采集與分析

根據(jù)已建立方法，將原始LC-MS數(shù)據(jù)導(dǎo)入Skyline軟件分析39種靶向鞘脂。在建立的極性脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)保留時(shí)間和準(zhǔn)確質(zhì)量對鞘脂種類進(jìn)行相對定量。使用SIMCA-P 12.0軟件進(jìn)行多變量分析[10]。

2 結(jié)果

2.1 血清參數(shù)比較

結(jié)果見表1所列。高脂血癥模型組TG、TC、LDL-C，HDL-C水平明顯高于正常對照組，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

表1 金黃地鼠血清中TG、TC、LDL-C 及 HDL-C 水平Table 1 Level of serum TG，TC，LDL-C and HDL-C in hamsters

2.2 組織病理學(xué)

如圖1所示，正常對照組肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索圍繞中央靜脈呈放射狀分布，排列整齊有序，肝竇充盈、可見，肝細(xì)胞未見腫脹變性，匯管區(qū)未見炎細(xì)胞浸潤及纖維組織增生。

圖1 HE 染色的病理圖(×200)Fig.1 Micrographs of hyperlipidemia hamster(×200)

高脂血癥模型組肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞大片氣球樣變性，灶性小泡性脂肪變，肝細(xì)胞肥大致肝竇不明顯，枯否細(xì)胞增生，肝小葉內(nèi)可見炎細(xì)胞聚集灶，匯管區(qū)輕度炎細(xì)胞浸潤及纖維組織增生。

2.3 多元數(shù)據(jù)分析

圖2顯示了肝勻漿液靶向代謝組研究的PCA和PLS-DA評分圖。結(jié)果表明，與正常對照組比較，高脂血癥模型組肝臟鞘脂代謝變化更為顯著。數(shù)據(jù)模型顯示區(qū)分效果良好，相關(guān)參數(shù)：對于PLS-DA模式(R2Y=0.993，Q2=0.939)，PCA(R2X=0.866，Q2=0.729)。VIP值反映了各變量(代謝物)對分類的影響，經(jīng)PLS-DA處理后生成。從t檢驗(yàn)中篩選出VIP>1、fold變化>1.5、P<0.05的潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行進(jìn)一步研究。共鑒定出21種潛在的鞘脂生物標(biāo)志物，包括8種SM、4種Glu-cer和9種Cer。潛在生物標(biāo)志物變化趨勢見圖3。

圖2 基于LC-MS的PCA和PLS-DA評分圖Fig.2 PCA and PLS-DA score plots based on data from LC-MS

圖3 肝臟鞘脂熱圖Fig.3 Heatmap of the sphingolipids in liver

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，鞘脂代謝途徑的主要成分在心血管疾病、肥胖癥、糖尿病、胰島素抵抗和非酒精性脂肪肝疾病中都起著重要作用[11-13]。 鞘脂中各類成分之間的相互代謝都發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，如鞘磷脂與神經(jīng)酰胺之間的代謝被激活會(huì)發(fā)揮促炎癥、促氧化和細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，衰老和心血管事件。 此外，近年來也發(fā)現(xiàn)鞘磷脂-神經(jīng)酰胺-鞘糖脂通路中的成分作為潛在的次級信使分子直接或間接影響細(xì)胞和亞細(xì)胞器，在胰島素抵抗和脂肪肝的病理狀態(tài)中發(fā)揮著重要作用，可能是新的治療靶點(diǎn)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)高脂血癥患者肝臟中4種Glc-cer和5種鞘磷脂呈下降趨勢，另外3種鞘磷脂和9種神經(jīng)酰胺均呈上升趨勢，提示鞘脂代謝的整體異常。

神經(jīng)酰胺在各種鞘脂的合成和分解代謝中起著關(guān)鍵作用。在鞘磷脂-神經(jīng)酰胺-鞘糖脂途徑中，神經(jīng)酰胺的主要是通過鞘磷脂酶水解神經(jīng)鞘磷脂而生成[15]，而葡萄糖神經(jīng)酰胺和半乳糖神經(jīng)酰胺通過葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的分解生成神經(jīng)酰胺[16]。神經(jīng)酰胺被認(rèn)為是胰島素抵抗和不同器官炎癥的重要脂質(zhì)介質(zhì)。許多研究表明神經(jīng)酰胺與胰島素敏感性呈負(fù)相關(guān)，與炎癥呈正相關(guān)，肥胖的嚙齒動(dòng)物和人類的血清和肝臟中神經(jīng)酰胺的含量都會(huì)升高[17-18]，血脂異常和炎癥是非酒精性脂肪肝和動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的共同關(guān)鍵因素。肝代謝異常不僅導(dǎo)致脂肪肝脂肪變性的發(fā)生，而且增加了動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)。此外，升高的肝神經(jīng)酰胺可能導(dǎo)致循環(huán)神經(jīng)酰胺水平升高，從而通過直接損傷血管內(nèi)皮促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化[19]。

鞘磷脂是脂蛋白中含量最豐富的鞘脂，約占血漿總鞘脂的87%，占血漿總磷脂的20%。鞘磷脂由神經(jīng)酰胺通過鞘磷脂合酶產(chǎn)生[20]。和神經(jīng)酰胺一樣，鞘磷脂也是心血管疾病的危險(xiǎn)因素，據(jù)報(bào)道，主動(dòng)脈中高濃度的鞘磷脂可能有害，致動(dòng)脈粥樣硬化的脂蛋白，如VLDL和LDL都是富含鞘磷脂的[21]。高脂血癥金黃地鼠肝臟中鞘磷脂水平呈現(xiàn)不同的變化趨勢，大部分鞘磷脂呈顯著的減少趨勢，這也可能表明鞘脂代謝的被激活的方向是產(chǎn)生神經(jīng)酰胺，而不是生成鞘磷脂。但由于SM的組成復(fù)雜，含量高，其代謝異常的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。葡糖神經(jīng)酰胺是由葡糖神經(jīng)酰胺合酶(GCS)引起的神經(jīng)酰胺糖基化反應(yīng)形成的，GCS將葡萄糖與神經(jīng)酰胺的1-羥基連接起來。葡糖神經(jīng)酰胺與炎癥、糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)[22]。本研究中Glc-cer的降低可能表明神經(jīng)酰胺的糖基化作用降低，導(dǎo)致神經(jīng)酰胺的升高[19]。

從文獻(xiàn)中可以看出，這三種成分對肝臟和心血管系統(tǒng)都有不良影響。然而，在高脂血癥的早期，鞘脂的變化并不是都升高，其代謝途徑主要還是朝著激活生成神經(jīng)酰胺的方向變化[8]。神經(jīng)酰胺在鞘脂的代謝過程和生物功能方面，都發(fā)揮著中心作用[23]。根據(jù)我們的研究，在高脂血癥的早期，神經(jīng)酰胺和鞘磷脂或葡萄糖神經(jīng)酰胺之間的肝臟平衡被打破，可能導(dǎo)致神經(jīng)酰胺升高的原因之一，脂質(zhì)代謝的異常，最先導(dǎo)致神經(jīng)酰胺的升高，其可能引起肝功能異常，從而導(dǎo)致包括鞘脂在內(nèi)的脂質(zhì)代謝的進(jìn)一步紊亂。

本研究采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對高脂血癥金黃地鼠肝組織中的鞘脂類成分進(jìn)行了靶向代謝組學(xué)研究。21種與動(dòng)脈粥樣硬化高度相關(guān)的鞘磷脂、神經(jīng)酰胺和葡糖基神經(jīng)酰胺在高脂血癥倉鼠肝臟出現(xiàn)異常改變。其中，只有神經(jīng)酰胺呈現(xiàn)較為明顯上升趨勢，表明鞘脂的代謝途徑中被激活的生成是神經(jīng)酰胺的途徑，提示神經(jīng)酰胺的增加可能是倉鼠動(dòng)脈粥樣硬化早期肝臟病變的主要特征。這種增加可能進(jìn)一步導(dǎo)致鞘脂代謝功能障礙，甚至導(dǎo)致脂質(zhì)損傷肝臟或內(nèi)皮細(xì)胞。研究也表明，基于LC-MS的靶向代謝組學(xué)是進(jìn)一步了解動(dòng)脈粥樣硬化早期脂質(zhì)功能障礙機(jī)制的有效工具。