劉佳奇，都海渤，陳怡文，張彩文，辛迪，石靚，李金霞，崔生輝，姚粟*

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015)2(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京，100050)

食品微生物檢驗(yàn)是保證食品安全的重要措施，在檢驗(yàn)過(guò)程中，需根據(jù)不同微生物種屬的特點(diǎn)選擇對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè),因此培養(yǎng)基及試劑的質(zhì)量控制尤為重要。早在20世紀(jì)80年代，國(guó)際食品微生物學(xué)和衛(wèi)生學(xué)委員會(huì)培養(yǎng)基工作組(The International Committee for Food Microbiology and Hygiene，ICFMH)、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(International Standards Organization，ISO)、食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)相繼建立了完整的培養(yǎng)基質(zhì)控體系[1-3]。近年來(lái)，國(guó)家頒布的各類標(biāo)準(zhǔn)都對(duì)培養(yǎng)基的質(zhì)量控制制定了嚴(yán)格規(guī)定[4-8]。GB 4789.28—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》提出用測(cè)試菌株來(lái)評(píng)價(jià)培養(yǎng)基的微生物性能指標(biāo)，測(cè)試菌株是具有其代表種的穩(wěn)定特性并能有效證明特定培養(yǎng)基最佳性能的一套菌株，主要購(gòu)于標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心，也可以是實(shí)驗(yàn)室自己分離的具有良好特性的菌株。此外，測(cè)試菌株最好使用從食品或水中分離的菌株[9]。

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)屬于革蘭氏陰性短桿菌，是食源性疾病的主要病原菌之一。該菌作為常用質(zhì)控菌株，已被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域[10-12]。GB 4789.28—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》附錄D中，僅推薦了1株大腸埃希氏菌ATCC 25922，涉及評(píng)價(jià)6類共58種培養(yǎng)基的質(zhì)量。質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室在驗(yàn)收培養(yǎng)基時(shí)，可采用多株特性良好的菌株進(jìn)行質(zhì)控。CICC 24652和CICC 24176為我國(guó)公開保藏菌株，分類學(xué)地位明確，分別來(lái)源于果仁菠菜和地表水。以這2株測(cè)試菌株為代表，考察其對(duì)培養(yǎng)基的靈敏度和指示能力，以期為國(guó)標(biāo)中大腸埃希氏菌的補(bǔ)充或替換提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

E.coliCICC 24176、CICC 24652保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，E.coliATCC 25922來(lái)源于美國(guó)典型菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂(nutrient agar，NA)、胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptic soy agar，TSA)、平板計(jì)數(shù)瓊脂(plate count agar，PCA)、麥康凱瓊脂(macconkey agar，MAC)、伊紅美藍(lán)瓊脂(eosin-methylene blue agar，EMB)、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(violet red bile agar，VRBA)、HE瓊脂(hektoen enteric agar，HE)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(xylose lysine desoxycholate agar，XLD)、亞硫酸鉍瓊脂(bismuth sulfite agar，BS)、李氏增菌肉湯(Listeriaenrichment broth base，LB1，LB2)、EC肉湯(E.Colibroth，EC)、三糖鐵瓊脂、尿素瓊脂(pH 7.2)、月桂基磺酸鹽胰蛋白胨肉湯(lauryl sulfate tryptose broth，LST)、煌綠乳糖膽鹽肉湯(brilliant green lactose bile broth，BGLB)、腦心浸液、MUG-LST、氧化酶試劑等，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(selenite cystine broth，SC)、黏液酸發(fā)酵管，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；緩沖動(dòng)力硝酸鹽發(fā)酵管，青島海博有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 非選擇性分離和計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基生長(zhǎng)率定量測(cè)試方法

測(cè)試菌株與對(duì)照菌株分別制備濃度為200～2 000 CFU/mL的菌懸液，接種量為0.1 mL，均勻涂布于待測(cè)平板和TSA參比平板，每一稀釋度接種2個(gè)平板。待測(cè)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件見GB 4789.28—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》附錄D，NA、TSA在(36±1)℃培養(yǎng)24 h，PCA在(36±1)℃培養(yǎng)48 h。以生長(zhǎng)率≥0.7為指標(biāo)考察2株測(cè)試菌株的生長(zhǎng)能力。生長(zhǎng)率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：PR,生長(zhǎng)率；NS,待測(cè)培養(yǎng)基平板上得到的菌落總數(shù)；N0,參比培養(yǎng)基平板上獲得的菌落總數(shù)。

1.3.2 選擇性分離和計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基的測(cè)試方法

1.3.2.1 生長(zhǎng)率定量測(cè)試方法

工作菌懸液制備及接種方法同1.3.1，培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件見GB 4789.28—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》附錄D，MAC、EMB、VRBA、VRB-MUG瓊脂均在(36±1)℃培養(yǎng)24 h。對(duì)照ATCC 25922，以生長(zhǎng)率及菌落特征為指標(biāo)考察測(cè)試菌株的生長(zhǎng)能力，要求菌株在選擇性分離培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)率≥0.5，最低為0.1；在選擇性計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)率≥0.7，特征反應(yīng)與對(duì)照菌株表現(xiàn)一致。

1.3.2.2 (選擇性)半定量測(cè)試方法

測(cè)試菌株與對(duì)照菌株分別接種于BHI肉湯，36 ℃培養(yǎng)18 h。用1 μL接種環(huán)取1環(huán)，在測(cè)試培養(yǎng)基上劃6條平行直線，同時(shí)接種2個(gè)平板。培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件見GB 4789.28—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》附錄D，PALCAM瓊脂、李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、BS均在(36±1)℃培養(yǎng)48 h；改良CCD(modified CCD,mCCD)瓊脂、Skirrow瓊脂、Baird-Parker瓊脂均在(42±1)℃培養(yǎng)48 h；甘露醇卵黃多粘菌素(mannitol egg yolk polymyxin，MYP) 瓊脂在(30±2)℃培養(yǎng)48 h，其余培養(yǎng)基均在(36±1)℃培養(yǎng)24 h。對(duì)照ATCC 25922，以生長(zhǎng)指數(shù)G<5為指標(biāo)考察測(cè)試菌株生長(zhǎng)能力。

生長(zhǎng)指數(shù)G的計(jì)算方法是觀察平板上6條線的生長(zhǎng)情況，有比較稠密菌落生長(zhǎng)的劃線G為1，每個(gè)培養(yǎng)皿最多為6分。如果僅一半的線有稠密的菌落生長(zhǎng)，則G為0.5。如果劃線上沒有菌落生長(zhǎng)、生長(zhǎng)量少于劃線的一半或菌落生長(zhǎng)微弱，則G為0。

1.3.2.3 (特異性)定性測(cè)試方法

工作菌懸液制備方法同1.3.2.2。用1 μL接種環(huán)取1環(huán)，分別在測(cè)試培養(yǎng)基表面四區(qū)劃線。培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件見GB 4789.28—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》附錄D，沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、CT-SMAC、O157顯色培養(yǎng)基、志賀氏菌顯色培養(yǎng)基、阪崎克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基均在(36±1)℃培養(yǎng)24 h；CIN-1、改良Y培養(yǎng)基均在(26±1)℃培養(yǎng)48 h。對(duì)照ATCC 25922，以典型菌落特征為指標(biāo)考察測(cè)試菌株在不同培養(yǎng)基的特征反應(yīng)能力。

1.3.3 選擇性增菌培養(yǎng)基的半定量測(cè)試方法

測(cè)試菌株與對(duì)照菌株分別制備濃度為1 000～5 000 CFU/mL的菌懸液。接種1 mL菌液至10 mL增菌培養(yǎng)基中，2個(gè)平行管，同時(shí)傾注TSA平板確定接種量。培養(yǎng)后吸取10 μL培養(yǎng)液，均勻涂布TSA平板，每管接種1個(gè)平板。培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件見GB 4789.28—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》附錄D，LB1，LB2在(30±1)℃培養(yǎng)24 h，改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)古霉素在(44±0.5)℃培養(yǎng)24 h；其余培養(yǎng)基均在(36±1)℃培養(yǎng)24 h。對(duì)照ATCC 25922，以培養(yǎng)后菌落數(shù)<100 CFU為指標(biāo)考察測(cè)試菌株對(duì)選擇性增菌培養(yǎng)基的識(shí)別能力。

1.3.4 選擇性液體計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的半定量測(cè)試方法

測(cè)試菌株與對(duì)照菌株分別制備濃度為10～100 CFU/mL的工作菌懸液。接種1 mL菌液至10 mL的培養(yǎng)基中，同時(shí)傾注TSA平板確定接種量，培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件見GB 4789.28—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》附錄D，LST、BGLB在(36±1)℃培養(yǎng)48 h；EC肉湯在(44.5±0.2)℃培養(yǎng)48 h。對(duì)照ATCC 25922，以培養(yǎng)后液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)濁度達(dá)到2為指標(biāo)考察測(cè)試菌的生長(zhǎng)能力。

1.3.5 懸浮培養(yǎng)基的定量測(cè)試方法

測(cè)試菌株與對(duì)照菌株分別制備濃度為100～1 000 CFU/mL的工作菌懸液。接種1 mL菌液至10 mL磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)測(cè)試培養(yǎng)基中，2個(gè)平行管，混勻后每管取1 mL懸液傾注TSA平板，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。剩余已接種菌液的PBS培養(yǎng)基置(20～25)℃放置45 min后，再每管吸取1 mL傾注TSA平板。對(duì)照ATCC 25922，以放置后菌落數(shù)的變化程度在±50%為指標(biāo)考察測(cè)試菌在PBS培養(yǎng)基中的穩(wěn)定能力。

1.3.6 鑒定培養(yǎng)基測(cè)試

測(cè)試菌株與對(duì)照菌株分別接種BHI肉湯和TSA培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件見GB 4789.28—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》附錄D，醋酸鹽利用試驗(yàn)、黏液酸利用試驗(yàn)均在(36±1)℃培養(yǎng)48 h；含鐵牛乳培養(yǎng)基在(46±0.5)℃培養(yǎng)2 h與5 h均觀察；明膠培養(yǎng)基在(36±1)℃培養(yǎng)72 h；酪蛋白瓊脂在(30±1)℃培養(yǎng)24 h；氧化酶試劑直接觀察結(jié)果；其余培養(yǎng)基均在(36±1)℃培養(yǎng)24 h。對(duì)照ATCC 25922，以典型菌落特征為指標(biāo)考察測(cè)試菌株在不同鑒定培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 非選擇性分離和計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基生長(zhǎng)率定量測(cè)試結(jié)果

生長(zhǎng)率能客觀地、量化地評(píng)估培養(yǎng)基對(duì)目標(biāo)菌生長(zhǎng)繁殖的影響[13]，菌株生長(zhǎng)率越高說(shuō)明培養(yǎng)基對(duì)目標(biāo)菌的促生長(zhǎng)能力越強(qiáng)。GB 4789.28—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》附錄D中，大腸埃希氏菌質(zhì)控的非選擇性固體培養(yǎng)基有營(yíng)養(yǎng)瓊脂NA、TSA和PCA，要求菌株生長(zhǎng)率≥0.7，即培養(yǎng)基質(zhì)量合格，因此，需要確認(rèn)測(cè)試菌株在該類培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)能力。

NA、TSA和PCA作為通用培養(yǎng)基，適合大部分微生物的生長(zhǎng)。測(cè)試菌株在該類培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況見表1，CICC 24176在3種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)率≥1.0，CICC 24652的生長(zhǎng)率≥0.9，對(duì)照菌株ATCC 25922的生長(zhǎng)率≥0.9。結(jié)果表明，2株測(cè)試菌生長(zhǎng)能力良好，可用于該類培養(yǎng)基的定量質(zhì)控。

2.2 選擇性分離和計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基的測(cè)試結(jié)果

2.2.1 生長(zhǎng)率定量測(cè)試結(jié)果

GB 4789.28—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》附錄D中，大腸埃希氏菌質(zhì)控的選擇性分離和計(jì)數(shù)培養(yǎng)基有MAC、EMB、VRBA和VRB-MUG瓊脂，這些培養(yǎng)基均用于大腸菌群的檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)要求大腸埃希氏菌作為目標(biāo)菌，在選擇性分離培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)率≥0.5，最低為0.1；在選擇性計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)率≥0.7，即培養(yǎng)基質(zhì)量合格。因此，需要確認(rèn)測(cè)試菌株在該類培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)能力及特征反應(yīng)。

由表2和圖1可知，測(cè)試菌株在4種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)率均≥0.8，菌落特征也與ATCC 25922表現(xiàn)一致。說(shuō)明測(cè)試菌株生長(zhǎng)能力良好，菌落特征明顯，可用于該類培養(yǎng)基的定量質(zhì)控。

A1～D1、A2～D2、A3～D3分別為ATCC 25922、CICC 24176和CICC 24652在4種培養(yǎng)基的菌落特征；培養(yǎng)基A～D依次為MAC、EMB、VRBA和VRB-MUG圖1 菌株在4種培養(yǎng)基上的菌落特征Fig.1 Characteristic reactions of strains on four medium

表2 生長(zhǎng)率定量測(cè)試結(jié)果Table 2 Result of growth rate quantitative test

2.2.2 半定量(選擇性)測(cè)試結(jié)果

選擇性培養(yǎng)基是一類支持目標(biāo)菌生長(zhǎng)而抑制非目標(biāo)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，通過(guò)生長(zhǎng)指數(shù)G來(lái)反映結(jié)果，G值越低，說(shuō)明培養(yǎng)基對(duì)非目標(biāo)菌的選擇性越強(qiáng)。GB 4789.28—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》附錄D將大腸埃希氏菌作為非目標(biāo)菌評(píng)價(jià)培養(yǎng)基的選擇性，要求生長(zhǎng)指數(shù)G≤1，至少應(yīng)達(dá)到<5。因此，需要確認(rèn)測(cè)試菌株在該類培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)能力。

大腸埃希氏菌涉及評(píng)價(jià)13種選擇性培養(yǎng)基，由表3可知，測(cè)試菌株呈現(xiàn)弱生長(zhǎng)或被完全抑制。菌株CICC 24176在HE、XLD培養(yǎng)基的生長(zhǎng)指數(shù)G=2，其余培養(yǎng)基生長(zhǎng)指數(shù)G≤1。菌株CICC 24652僅在HE培養(yǎng)基的生長(zhǎng)指數(shù)G=1.5，其余培養(yǎng)基生長(zhǎng)指數(shù)G≤1。對(duì)照菌株ATCC 25922在HE、XLD培養(yǎng)基的生長(zhǎng)指數(shù)1

表3 半定量(選擇性)測(cè)試結(jié)果Table 3 Result of semi-quantitative(selective)test

2.2.3 定性(特異性)測(cè)試結(jié)果

特異性培養(yǎng)基是一類通過(guò)顯色反應(yīng)區(qū)分目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的培養(yǎng)基，比如顯色培養(yǎng)基是根據(jù)目標(biāo)菌的一種或多種特異性的酶水解顯色底物使菌落本身顯色從而快速篩選目標(biāo)菌的方法，而非目標(biāo)菌通常會(huì)呈現(xiàn)其他顏色或被抑制[14-15]。國(guó)標(biāo)要求大腸埃希氏菌作為非目標(biāo)菌，應(yīng)呈現(xiàn)相應(yīng)的菌落特征。因此，需要確認(rèn)測(cè)試菌株的指示能力。

參照產(chǎn)品說(shuō)明，阪崎克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基使用說(shuō)明為阪崎腸桿菌顯藍(lán)綠色，其他腸桿菌無(wú)色或被抑制；改良Y和CIN-1培養(yǎng)基用于分離小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌；CT-SMAC用于大腸桿菌O157的分離培養(yǎng)；志賀氏菌顯色培養(yǎng)基用于志賀氏菌的顯色培養(yǎng)，應(yīng)為白色，清晰的菌落，周圍培養(yǎng)基紫紅色，其他菌為黃色、藍(lán)綠色或被抑制。由表4和圖2可知，2株測(cè)試菌株在以上培養(yǎng)基上的特征反應(yīng)均與ATCC 25922無(wú)差異。沙門氏菌在沙門氏菌顯色培養(yǎng)上顯紫色，其他菌為藍(lán)綠色、無(wú)色或不生長(zhǎng)。2菌株顯色表現(xiàn)均為非沙門菌的特征，但CICC 24176菌落為白色，CICC 24652生長(zhǎng)菌落為藍(lán)綠色，ATCC 25922菌落亦為藍(lán)綠色；O157顯色培養(yǎng)基用于O157菌的顯色培養(yǎng)，菌落顯(淡)紫紅色，其他菌為無(wú)色、藍(lán)綠色或不生長(zhǎng)。CICC 24176在此培養(yǎng)基上被抑制未生長(zhǎng)，CICC 24652菌落為淺灰色，而ATCC 25922同樣被抑制，僅在平皿一區(qū)生長(zhǎng)了藍(lán)綠色單菌落。不同菌株引起的特異性酶反應(yīng)不同是產(chǎn)生菌株顯色差異的主要原因。綜上可知，2株測(cè)試菌株在部分培養(yǎng)基上存在生長(zhǎng)特性的差異，但均是非目標(biāo)菌的特征，可用于該類培養(yǎng)基的定性質(zhì)控。

表4 定性(特異性)測(cè)試結(jié)果Table 4 Result of qualitative(specificity)test

2.3 選擇性增菌培養(yǎng)基測(cè)試結(jié)果

選擇性增菌培養(yǎng)基是能夠允許特定微生物在其中繁殖，而部分或全部抑制其他微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。GB 4789.28—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》附錄D中，大腸埃希氏菌作為非目標(biāo)菌涉及對(duì)9種選擇性增菌培養(yǎng)基進(jìn)行評(píng)價(jià)，要求菌株培養(yǎng)后菌落數(shù)應(yīng)<100 CFU，即培養(yǎng)基合格。因此，需要考察測(cè)試菌株在該類培養(yǎng)基上的被抑制程度。

A1～G1、A2～G2、A3～G3分別代表菌株ATCC 25922，CICC 24176，CICC 24652的菌落特征;培養(yǎng)基A～G順序依次為阪崎克羅諾桿菌顯色、CIN-1、CT-SMAC、改良Y、志賀氏菌顯色、沙門氏菌顯色和O157顯色培養(yǎng)基圖2 特異性培養(yǎng)基上的菌落特征Fig.2 Characteristic reactions of strains on specific medium

由表5可知，菌株CICC 24652在9種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)均被有效抑制，與ATCC 25922表現(xiàn)一致，菌落數(shù)<100 CFU。CICC 24176在8種培養(yǎng)基上表現(xiàn)與ATCC 25922一致，僅在SC上培養(yǎng)后菌落數(shù)超過(guò)100 CFU。SC培養(yǎng)基可對(duì)傷寒及其他沙門菌做選擇性增菌，其中的亞硒酸鹽有劇毒，可抑制非沙門氏菌的大多數(shù)革蘭氏陰性腸道菌，而菌株CICC 24176未被抑制，說(shuō)明該菌對(duì)亞硒酸鹽的毒性不敏感，這可能與該類菌具有某些特異性酶有關(guān)[13]。

表5 選擇性增菌培養(yǎng)基測(cè)試結(jié)果Table 5 Result of selective enrichment medium test

2.4 選擇性液體計(jì)數(shù)培養(yǎng)基測(cè)試結(jié)果

BGLB、LST肉湯均用于大腸菌群、大腸桿菌的測(cè)定；EC肉湯液體培養(yǎng)基用于糞大腸菌群、大腸桿菌的測(cè)定。 GB 4789.28—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》規(guī)定用目測(cè)的濁度值評(píng)估結(jié)果，0表示無(wú)渾濁，1表示很輕微混濁，2表示嚴(yán)重混濁。要求大腸埃希氏菌作為目標(biāo)菌，培養(yǎng)后濁度值應(yīng)為2，產(chǎn)氣應(yīng)為1/3或以上，培養(yǎng)基才合格。因此，需要考察測(cè)試菌株在此類培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)能力。

由表6可知，測(cè)試菌株在3種肉湯液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)濁度均為2，產(chǎn)氣情況為1/3，與ATCC 25922表現(xiàn)一致，可用于選擇性液體計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

表6 選擇性液體計(jì)數(shù)培養(yǎng)基測(cè)試結(jié)果Table 6 Result of selective liquid counting medium test

2.5 懸浮培養(yǎng)基測(cè)試結(jié)果

PBS用于菌落總數(shù)，大腸菌群，金黃色葡萄球菌的樣品制備。GB 4789.28—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》附錄D要求大腸埃希氏菌在PBS中放置45 min前后菌落數(shù)變化在±50%，即培養(yǎng)基合格。因此，需要確認(rèn)測(cè)試菌株在PBS中的穩(wěn)定情況。

由表7可知，測(cè)試菌株的菌落數(shù)變化程度均<10%，ATCC 25922菌落數(shù)變化為20%，說(shuō)明測(cè)試菌株的穩(wěn)定性更好，可用于懸浮培養(yǎng)基的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

表7 懸浮培養(yǎng)基測(cè)試結(jié)果Table 7 Result of suspension medium test

2.6 鑒定培養(yǎng)基及試劑測(cè)試結(jié)果

GB 4789.28—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》附錄D中大腸埃希氏菌共質(zhì)控18種鑒定培養(yǎng)基，因此，需要確認(rèn)測(cè)試菌株在相應(yīng)培養(yǎng)基上的典型特征。由表8可知，菌株CICC 24176在18種鑒定培養(yǎng)基上呈現(xiàn)典型特征且與ATCC 25922一致，菌株CICC 24652在16種鑒定培養(yǎng)基上呈現(xiàn)典型特征且與ATCC 25922一致。由圖3可知，菌株CICC 24652沒有動(dòng)力，在SIM(hydrogen sulfide indole motility)動(dòng)力及緩沖動(dòng)力硝酸鹽培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為陰性。

表8 鑒定培養(yǎng)基測(cè)試結(jié)果Table 8 Result of identification medium test

從左至右菌株順序?yàn)榭瞻?，ATCC 25922，CICC 24176，CICC 24652a-SIM動(dòng)力；b-緩沖動(dòng)力硝酸鹽圖3 SIM和緩沖動(dòng)力硝酸鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Test on SIM and buffer power nitrate

3 結(jié)論與討論

通過(guò)研究測(cè)試菌株E.coliCICC 24176和CICC 24652在6類58種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性，評(píng)估菌株質(zhì)控食品檢驗(yàn)培養(yǎng)基的適用性。2株測(cè)試菌分別在非選擇性分離和計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基、選擇性分離和計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基、選擇性增菌培養(yǎng)基、選擇性液體計(jì)數(shù)培養(yǎng)基、懸浮培養(yǎng)基和鑒定培養(yǎng)基上呈現(xiàn)各自特點(diǎn)。CICC 24176在57種培養(yǎng)基上呈現(xiàn)典型生長(zhǎng)特性且與ATCC 25922表現(xiàn)一致，CICC 24652在56種培養(yǎng)基上呈現(xiàn)典型生長(zhǎng)特性且與ATCC 25922表現(xiàn)一致，二者可分別用于評(píng)價(jià)相應(yīng)培養(yǎng)基的微生物指標(biāo)。本研究結(jié)果對(duì)補(bǔ)充新的大腸埃希氏菌質(zhì)控菌株具有很好的借鑒意義。

研究發(fā)現(xiàn)，測(cè)試菌株雖然都是大腸埃希氏菌，但不同菌株間特性差異明顯，在驗(yàn)證SC培養(yǎng)基時(shí)，大腸作為非目標(biāo)菌生長(zhǎng)應(yīng)被抑制，但菌株CICC 24176未受影響。SC培養(yǎng)液中的亞硒酸鹽并不能抑制所有大腸，有文獻(xiàn)報(bào)道，某些菌株具有較高的超氧化物歧化酶活性可以抵抗亞硒酸鹽的毒害作用[16]。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)菌株CICC 24652無(wú)動(dòng)力特性，鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官，約50%左右的大腸埃希氏菌有鞭毛[17]，而動(dòng)力特性與菌株鞭毛的個(gè)數(shù)、長(zhǎng)短及培養(yǎng)條件均有關(guān)[18-20]。后續(xù)將對(duì)這2株菌的相應(yīng)特征進(jìn)行深入研究，探究其中的機(jī)理。BARTL[21]在1985年曾提出用于培養(yǎng)基測(cè)試的質(zhì)控菌株既要選擇具有典型生長(zhǎng)特性的菌株，也要兼顧呈現(xiàn)差異性生長(zhǎng)的非典型菌株。本研究結(jié)果也證實(shí)了菌株水平間的差異，建議質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室使用多株菌對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)量進(jìn)行驗(yàn)收，從而提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。