梁清文，周朝暉，李鐵橋，盧麗玲，劉佳樂，方芳*

1(江南大學(xué),未來食品科學(xué)中心，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 3(廣東珠江橋生物科技股份有限公司，廣東 中山，528415)

在食品加工的過程中，原料帶菌和加工環(huán)境、設(shè)備染菌都可能導(dǎo)致食品在加工過程中污染腐敗微生物從而影響食品質(zhì)量和貨架期品質(zhì)[1-2]。腐敗微生物對食品品質(zhì)和食品安全的影響包括降解食品中蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)成分，產(chǎn)生氣體引起包裝脹起或出現(xiàn)異味，產(chǎn)生有機堿、細菌毒素等有毒物質(zhì)，分解食品中淀粉類大分子物質(zhì)改變食品的物理性狀等。對腐敗微生物進行分離培養(yǎng)，采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法一步分離可以獲得主要的腐敗菌[3-6]，但是對不可培養(yǎng)微生物或者難培養(yǎng)菌，則需要全面的分析才能制定培養(yǎng)條件。因此，可以通過宏基因組測序技術(shù)揭示食品原料和食品加工過程中各類半成品以及成品中的微生物組成，可為識別潛在的食品腐敗菌、降低腐敗微生物對食品品質(zhì)的影響，開發(fā)或制定有效的預(yù)防措施提供參考。通過宏基因組測序技術(shù)對奶粉加工過程物料中菌落組成的動態(tài)變化分析發(fā)現(xiàn)，奶粉中腐敗菌最初為嗜冷的假單胞菌(Pseudomonas)和不動桿菌(Acinetobacter)，然后演變?yōu)槭葻岬臈珶峋?Thermus)和地芽孢桿菌(Geobacillus)。這為明確奶粉加工過程不同階段需重點監(jiān)控的影響食品品質(zhì)的細菌提供了依據(jù)[7]。對成品腐乳中的微生物組成結(jié)構(gòu)的分析表明，假單胞菌是腐乳中普遍存在的腐敗菌，而對風(fēng)味有重要影響的德巴利氏酵母菌(Debaryomyces)可能會引起脹罐[8]。將宏基因組測序技術(shù)與傳統(tǒng)的菌株分離培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)破布子乳桿菌(Lactobacilluspobuzihii)是造成醬油脹罐的微生物[9]。此外，通過微生物組成分析發(fā)現(xiàn)，四川泡菜母水中的主要真菌哈薩克斯坦酵母菌(Kazachstania)可能對泡菜品質(zhì)造成不良影響[10]。

蠔油是一種以蠔汁為基礎(chǔ)原料，通過加入食鹽、味精、醬油等調(diào)味料和增稠劑制成的復(fù)合調(diào)味品[11-12]。蠔油的生產(chǎn)過程主要分為4個流程：基礎(chǔ)原料混合，加入香鮮調(diào)味劑，滅菌，灌裝。淀粉液化分層是蠔油產(chǎn)品變質(zhì)的表現(xiàn)形式之一，這有可能是貯存條件不當(dāng)導(dǎo)致的水分析出，也可能是蠔油生產(chǎn)原料中含有產(chǎn)淀粉酶的耐熱菌株[13]，在條件合適時生長或繁殖從而水解蠔油中的淀粉，導(dǎo)致蠔油液化，影響產(chǎn)品后期品質(zhì)[14-16]。因此，本研究將通過宏基因組測序技術(shù)對蠔油、生產(chǎn)原料和物理狀態(tài)發(fā)生改變的蠔油半成品中的細菌組成進行解析，分離并鑒定淀粉利用菌株，為蠔油及其他含淀粉調(diào)味品中腐敗菌的溯源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠔油(國內(nèi)某品牌)購于超市。蠔油生產(chǎn)用原料蠔汁、香精和變性淀粉購于國內(nèi)相應(yīng)原料供應(yīng)企業(yè)。

土壤基因組抽提試劑盒，美國MoBio公司；細菌基因組DNA快速抽提試劑盒、PCR引物，生工生物工程(上海)股份有限公司；pfuPCR Master Mix，上海科晴生物技術(shù)有限公司。

營養(yǎng)肉湯(g/100mL)：蛋白胨1.0、牛肉膏0.3、氯化鈉0.5，pH 7.4，用于固體培養(yǎng)時添加瓊脂粉2.0。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱，常州首創(chuàng)儀器設(shè)備公司；PCR儀，美國Bio-Rad公司；UVmini-1280分光光度計，日本Shimadzu公司；SynergyH4/Elx800 酶標(biāo)儀，美國Bio Tek公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細菌基因組DNA制備與測序

樣品細菌基因的提取采用液氮研磨與試劑盒抽提相結(jié)合的方法。將樣品混合均勻后，稱取10.0 g至研砵中，加入液氮充分研磨、破碎細胞。使用MoBio公司的Power?Soil DNA Isolation Kit試劑盒提取并純化宏基因組DNA[17]。將達到標(biāo)準(zhǔn)的宏基因組DNA用16S rDNA通用引物341F、908R(表1)擴增[18]，擴增產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司Illumina MiSeq平臺測序。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers used in this work

1.3.2 測序數(shù)據(jù)處理與分析

獲得測序原始數(shù)據(jù)后，先對reads拼接并去除嵌合體，根據(jù)Barcode使數(shù)據(jù)回歸樣品并刪除片段長度小于200 bp、單堿基重復(fù)超過8個、含模糊堿基的序列，以得到高質(zhì)量序列文件。再使用核糖體數(shù)據(jù)庫項目(ribosomal database project，RDP)classifier貝葉斯算法對97%相似度水平的分類操作單元(operational taxonomic unit，OTU)代表序列進行分類學(xué)分析，并在門綱目科屬種水平統(tǒng)計樣品中的菌落組成[19]。最后利用MOTHUR軟件對樣品微生物群落進行Alpha多樣性分析等[20]。

1.3.3 半成品中淀粉利用微生物的分離與初步鑒定

通過將蠔汁和香精分別與淀粉混合制備成蠔油半成品，驗證原料中是否存在可使蠔油中淀粉水解的菌株。具體操作為：(1)蠔汁與淀粉混合物(mixture of oyster sauce and starch，MOS)：蠔汁常壓煮沸30 min，與煮沸15 min的改性淀粉(糊化淀粉)混合；(2)香精與淀粉混合物(mixture of essence and starch，MES)：香精煮沸10 min，與糊化淀粉混合。將MOS和MES置于室溫培養(yǎng)，待出現(xiàn)淀粉水解現(xiàn)象后取樣。使用梯度稀釋涂布平板法對水解樣品中的微生物進行分離，于37 ℃培養(yǎng)24 h并觀察菌落形態(tài)。

用生工生物工程(上海)股份有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA。利用通用引物27F和1492R擴增其16S rDNA，PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件具體為[21]：在50 μL體系中，含DNA模板2 μL(50 ng/μL)，pfuPCR MasterMix 25 μL，ddH2O 21 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)。PCR 擴增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。測序所得的16S rDNA序列與美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，用MEGA 7.0 以Neighbour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 樣品中代表性菌株計數(shù)與淀粉水解能力分析

分別取蠔油、蠔汁、香精、MOS和MES淀粉水解樣品，梯度稀釋后，取10-2、10-3、10-4、10-5稀釋度的菌液涂布，于37 ℃培養(yǎng)24 h后按照代表性菌株形態(tài)分別進行計數(shù)。

采用碘比色法測定菌株產(chǎn)淀粉酶水平[22]。將待檢測菌株接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)至OD600=1.0，離心取30 μL發(fā)酵上清液，加入70 μL 0.5 g/L可溶性淀粉溶液(pH 6.0、0.1 mol/L PBS溶液配制)于60 ℃下保溫10 min，加入50 μL 5 mol/L HCl溶液滅活，再添加50 μL碘液顯色。空白對照為加入50 μL 5 mol/L HCl滅活后再添加反應(yīng)底物，其他同實驗組一致。測定660 nm處吸光值。

參照所買納豆菌的使用說明，待蒸煮好的黃豆降溫至40 ℃左右，用40 ℃左右的水溶解納豆菌0.8%，均勻地撒在豆子上。

淀粉酶活力單位定義(U/mL)：在60 ℃條件下，1 min水解淀粉1 μg所用酶量為1個酶活力單位。淀粉酶酶活力根據(jù)公式(1)計算：

淀粉酶酶活力/(U·mL-1)

(1)

式中：淀粉消耗量，mg；反應(yīng)時間為10 min；發(fā)酵上清液體積為30 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠔油及原料中細菌Alpha多樣性分析

使用ACE、Chao1、Shannon及Simpson指數(shù)對蠔油及原料中的生物群落的豐度及多樣性進行評估。由表2可知，香精中細菌種類的ACE、Chao 1、Shannon指數(shù)均為最高，且Simpson指數(shù)也較高，因此香精中細菌組成最豐富。蠔汁和成品蠔油中的微生物多樣性低于香精。蠔汁與香精這2種原料分別與淀粉混合制得的蠔油半成品中物種豐度明顯降低，生物群落也趨于簡單，表明加工過程中的高溫處理能夠殺滅原料中的部分微生物。

表2 各樣品菌群的Alpha多樣性比較Table 2 Alpha diversity of bacterial flora of samples

2.2 蠔油及原料中細菌組成分析

成品蠔油中的細菌分布于20個門，其中厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)為主要細菌，它們的相對豐度之和占總細菌的98.5%(圖1-a)。蠔汁和香精中細菌種類分別包括18個門和13個門，厚壁菌門和變形菌門的微生物是蠔汁和香精中的主要細菌，它們在兩類樣品中的相對豐度之和>97%(圖1-b)。蠔汁和香精中分別有131和144個屬的細菌，其中兩者相同的細菌屬有82個(圖2)。2種原料中優(yōu)勢微生物(相對豐度>5%)的組成基本相似，在屬水平上相對豐度>1%的細菌包括動性微菌屬(Planomicrobium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和大腸埃希菌-志賀菌屬(Escherichia-Shigella)(圖1-b)。以上細菌屬在蠔汁中的豐度占比分別為45.83%、13.63%、4.58%、15.35%、11.66%和1.67%，而在香精中分別為55.03%、20.36%、6.88%、1.99%、1.58%和1.95%。成品蠔油中有178個細菌屬，其優(yōu)勢細菌屬的種類和豐度與2種原料有較大相似性。動性微菌屬、芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌、四聯(lián)球菌屬和大腸埃希菌-志賀菌屬相對豐度占比依次為55.17%、13.78%、4.84%、1.18%和1.08%。蠔油中的獨特性菌屬為黃單胞菌(Xanthomonas)和微小桿菌(Exiguobacterium)，分別占16.49%與1.22%。香精中獨特性菌屬為狹義梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)，相對豐度占4.79%。由此可知，假單胞菌和葡萄球菌等常見的蠔肉腐敗菌在蠔汁中占比小，而具有一定耐低溫能力的酸敗菌——乳桿菌，是蠔汁中的優(yōu)勢菌屬[23-24]。

a-細菌門水平組成;b-細菌屬水平組成圖1 蠔油、原料及加工后原料樣品中的細菌組成Fig.1 Bacterial composition of oyster sauce, raw materials and treated samples注：圖1-b中相對豐度(>0.01%)前29個屬單獨顯示，其他的合并為“other”；Clostridium為Clostridium_sensu_stricto_1；“蠔汁+淀粉”、“香精+淀粉”分別指MOS、MES水解樣品

圖2 蠔油及原料樣品中細菌屬數(shù)量的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of phylum number of oyster sauce and raw materials

對蠔汁和香精分別與糊化淀粉混合后發(fā)生淀粉水解的混合物MOS、MES中的微生物群落結(jié)構(gòu)分析表明，由于原料經(jīng)過煮沸處理，原料中含有的大多數(shù)細菌已被殺滅；MOS和MES中分別僅包含12個和3個細菌屬，兩者中的優(yōu)勢細菌屬為動性微菌和芽孢桿菌。MOS中動性微菌和芽孢桿菌相對豐度分別為84.46%和11.73%，在MES中這2個菌屬的相對豐度分別為4.95%和95.01%。芽孢桿菌在MES中的相對豐度大幅增加并成為絕對優(yōu)勢細菌屬，這可能對蠔油因淀粉水解而發(fā)生物理性狀改變有較大影響。

2.3 代表性菌株的分離與初步鑒定

表3 代表菌株的菌落特征及菌體形態(tài)Table 3 Colony characteristics and morphology of representative strains

圖3 基于16S rDNA序列構(gòu)建的代表性菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on the sequences of 16S rDNA of representative strains

2.4 代表性菌株在樣品中的數(shù)量分析與淀粉利用能力分析

2.2結(jié)果表明，蠔油產(chǎn)品中的微生物主要來源于加工的原料蠔汁和香精。分離自MOS和MES淀粉水解樣品的代表性菌株是否存在于蠔油中和具有利用淀粉的能力，還需進一步確認(rèn)。根據(jù)表3代表性菌株的菌落形態(tài)特征和圖3中菌種鑒定結(jié)果，選擇對4個代表所分離菌株全部屬種的S.hominisS1、B.velezensisS2、B.subtilisS3、A.pittiS6分析它們在蠔油、原料和淀粉水解混合物MOS與MES中的數(shù)量變化。由圖4-a可以看出，蠔油和蠔汁中均含有4個代表性菌株，香精中含有除A.pittiS6外的其他3個代表性菌株。蠔油和原料中4個代表性菌株的含量均低于105CFU/mL，當(dāng)蠔汁或香精與糊化淀粉混合物出現(xiàn)淀粉水解現(xiàn)象時，葡萄球菌和芽孢桿菌的數(shù)量均顯著增加，其中S.hominisS1數(shù)量增加最多，分別從2.6×103、3.6×103CFU/mL增加至4×107、8.5×106CFU/mL；B.velezensisS2 的數(shù)量分別從1.2×103、1.7×104CFU/mL增加至4×106、5×105CFU/mL；蠔汁中含有的B.subtilisS3在MOS水解樣品中低于檢測限，這可能是因為S3在蠔汁中含量較低，通過加工過程處理已基本殺滅，不會進一步增殖；MES中未計出A.pittiS6的數(shù)量，說明此菌與淀粉水解沒有較大關(guān)系。由此可見，生產(chǎn)蠔油用原料中含有的葡萄球菌和芽孢桿菌可能與淀粉水解密切相關(guān)。

為了評估從蠔油半成品淀粉被水解的混合物MOS、MES中分離到的代表性菌株是否具有水解淀粉的能力，通過分析菌株產(chǎn)淀粉酶水平比較它們對淀粉的水解能力。由圖4-b可以看出，芽孢桿菌S5和A.pittiS6淀粉酶活性極低，而葡萄球菌S1和芽孢桿菌S2、S3、S4都具有一定淀粉利用能力，其中芽孢桿菌S3產(chǎn)淀粉酶水平最高。依據(jù)菌株產(chǎn)淀粉酶活力水平，判斷它們的水解淀粉能力由高到低依次為S3、S2、S4、S1、S5、S6。結(jié)合蠔油及其原料中微生物組成分析和代表性菌株數(shù)量分析的結(jié)果，推斷芽孢桿菌和葡萄球菌是來源于蠔油生產(chǎn)原料并可使蠔油物理狀態(tài)發(fā)生改變(淀粉水解后水化)的潛在危害性細菌。

a-代表性菌株數(shù)量；b- 代表性菌株產(chǎn)淀粉酶能力分析圖4 蠔油原料及加工后產(chǎn)品中代表性菌株數(shù)量和產(chǎn)淀粉酶能力分析Fig.4 Quantification and detection of amylase level of typical strains in oyster sauce raw materials and corresponding products注：S1，人葡萄球菌；S2和S4，貝萊斯芽孢桿菌；S3和S5，枯草芽孢桿菌；S6， 皮特不動桿菌

3 結(jié)論

本研究通過16S rDNA擴增子測序分析證實，蠔油及生產(chǎn)原料蠔汁和香精中的優(yōu)勢細菌屬包括動性微菌屬、芽孢桿菌屬、黃單胞菌屬、四聯(lián)球菌屬和乳桿菌屬，蠔油中的細菌主要來源于其生產(chǎn)原料蠔汁和香精。此外，對蠔油生產(chǎn)過程物料中代表性細菌數(shù)量變化和其利用淀粉能力的分析表明，蠔油的生產(chǎn)原料香精和蠔汁中含有耐熱且可通過水解淀粉改變蠔油物理狀態(tài)的細菌，為人葡萄球菌、貝萊斯芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。以上結(jié)果證實，食品原料中含有食品腐敗細菌，如果在食品加工過程中對耐熱或抗逆性較強的微生物的殺滅不徹底，存在影響產(chǎn)品品質(zhì)和貨架期壽命的風(fēng)險。通過宏基因組測序分析樣品中微生物組成與菌株分離和代謝特性分析相結(jié)合的方法，可實現(xiàn)對影響食品品質(zhì)的微生物溯源，并為建立食品加工原料微生物控制標(biāo)準(zhǔn)以及開發(fā)含淀粉類調(diào)味品的防腐技術(shù)等方面的研究提供參考。