李佳釔，方佳興，李亞隆，孫文佳，劉平*，王芹

1(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都，610039)2(馬里蘭大學帕克分校 營養(yǎng)與食品科學系，馬里蘭 大學城，20740)

甜橙油具有橙子的特殊芳香滋味，被廣泛應用于煙草、日化和香精等領域[1]。但甜橙油作為一種液體狀香精，其香氣成分具有易揮發(fā)和易受光、熱、氧影響等缺點，從而限制了這些香精產(chǎn)品在某些領域的應用，目前，能對甜橙油進行有效保護，常見的方法是微膠囊法。常用的制備微膠囊的方法有噴霧干燥法、界面聚合法、原位聚合法和復合凝聚法等。

其中復合凝聚法中的反應，主要是2種或2種以上大分子之間由于靜電相互作用而發(fā)生的自聚集現(xiàn)象，是一種能有效使物質穩(wěn)定的包埋技術[2]。根據(jù)調節(jié)pH值，蛋白-多糖復合物可以遍布在整個體系中而不發(fā)生相分離，形成可溶性復聚物。隨著pH不斷減小，可溶性復聚物由于靜電作用發(fā)生聚集形成不溶性復聚物，體系同時發(fā)生相分離形成水相-復聚物相。根據(jù)靜電引力強度和生物大分子特性不同，不溶性復聚物能夠進一步沉降形成復凝聚液滴，復凝聚液滴經(jīng)沉降及融合形成復凝聚相，促成復凝聚反應，最終導致溶劑分為上清相和下層大分子物質富集的復凝聚相。此下層復凝聚相根據(jù)不同環(huán)境條件可以形成微米甚至納米級別的復聚物，因此可應用于食品組成、微膠囊體系或者生物材料中[3]。

目前對于復合凝聚反應的研究多集中于乳清分離蛋白[4]、β-乳球蛋白[5]和豌豆蛋白[6]等原蛋白與多糖作為壁材原料制備微膠囊。另外，大豆分離蛋白(soy protein isolate，SPI)也較常應用于復合凝聚制備微膠囊，如DONG等[7]以大豆分離蛋白與阿拉伯膠為微膠囊壁材原料，通過三相圖分析復合凝聚反應產(chǎn)物形成過程中相行為。然而，由于大豆分離蛋白功能性質，如溶解性和乳化性較差，而使其在工業(yè)應用上受限，雖然有關大豆分離蛋白改性的研究較多[8]，但目前對大豆分離蛋白改性后與多糖的復合凝聚反應這方面研究鮮少報道。

本文以SPI為原料，采用Fungal protease 400(F400)蛋白制備水解度為2%的酶解大豆蛋白(hydrolyzed soy protein isolate，HSPI)，使其與海藻酸鈉(sodium alginate，SA)為微膠囊壁材，進行復合凝聚反應，利用不同比例和不同溫度下pH-濁度曲線結合ζ-電位分析，確定復聚物生成的最佳條件。通過微膠囊理化指標、乳化活性(emulsification activity index，EAI)及乳化穩(wěn)定性(emulsion stability index，ESI)、熱重和揮發(fā)性風味物質等分析指標比較HSPI-SA甜橙油微膠囊(hydrolyzed soy protein isolate - sodium alginate capsule，HSC)和SPI與SA復合凝聚制備的微膠囊(soy protein isolate-sodium alginate capsule，ISC)的性質差異，以便根據(jù)食品工業(yè)應用要求選擇最佳的壁材原料制備相應需求的微膠囊。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(蛋白質量分數(shù)91.84%)，山東萬德福生物科技有限公司；F400蛋白酶，Enzyme Development公司；巴西天然甜橙油，廣州RHF香料公司；辛酸乙酯(色譜純)，上海安譜實驗科技股份有限公司；C6～C20正構烷烴標準品，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2450型分光光度計、DTG-60型差熱熱重同步分析儀、GCMS-QP 2010 Plus型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，日本島津儀器有限公司；PHS-320型顯數(shù)式pH計，成都世紀方舟科技有限公司；75 μm CAR/PDMS萃取頭，美國Supelco公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 HSPI的制備方法

將SPI粉末溶于適量的去離子水，制備5 g/L的蛋白溶液，加入適量的蛋白酶F400，在其最適溫度50 ℃和pH 7.0條件下進行水解，采用pH-stat[9]計算產(chǎn)物水解度。水解完成后，收集水解度為2%的水解產(chǎn)物，將其于95 ℃下加熱10 min后滅酶，并于4 000 r/min條件下離心15 min，上清液經(jīng)過冷凍干燥后即為HSPI。

1.3.2 壁材反應液的制備

參考HUANG等[10]的方法并稍作改變。將一定量的HSPI和SA用去離子水溶解后常溫下攪拌2 h，于室溫下3 000×g離心30 min，除去不溶性雜質及泡沫，分別用凱氏定氮法[11]和苯酚法[12]測定HSPI蛋白含量和SA中多糖含量，留待后續(xù)各反應進行。配制不同濃度的醋酸溶液用于滴定反應的不同階段。

1.3.3 壁材溶液的ζ-電位分析

分別配制0.1 g/L的HSPI和SA反應溶液，在室溫條件下利用不同濃度的醋酸溶液將其pH值調至2.5～6.0，將樣品分別置于樣品池中，用馬爾文納米粒度儀測定不同pH值下兩者的ζ-電位值。

1.3.4 濁度滴定曲線測定

采用KLEMMER等[13]的方法有所改變，分別配制質量濃度為1 g/L的HSPI和SA溶液，用0.1 mol/L的NaOH溶液調節(jié)初始pH值至6.0，勻速攪拌反應液，用醋酸調節(jié)溶液的pH值，取不同pH下的反應液于600 nm處測定吸光度值。

1.3.5 復聚物及微膠囊的制備

取相同質量的HSPI和SPI分別與SA以一定比例混合，溶于去離子水中使其混合液總質量濃度為10 g/L，在500 r/min攪拌速率下，緩慢用醋酸溶液調pH至特定值，反應30 min，即得到相應的復聚物溶液，經(jīng)冷凍干燥后制得固體粉末SPI-SA復聚物和HSPI-SA復聚物。

在上述混合溶液的基礎上，每100 mL混合溶液中加入1 mL甜橙油，在10 000 r/min的轉速下高速分散3 min，后續(xù)步驟同上即得到相應的HSC和ISC溶液，冷凍干燥后分別制得HSC和ISC固體粉末微膠囊。

1.3.6 微膠囊流動性的測定

固定圓錐法測定休止角的裝置由支架、漏斗、圓盤和刻度尺組成。將漏斗置于支架上，向漏斗內倒入干燥后制得的固體粉末微膠囊產(chǎn)品，使樣品通過漏斗落在下方固定直徑的圓盤上，粉體逐漸堆積，直至物料不能繼續(xù)堆高為止。用刻度尺測量物料堆高度，計算如公式(1)所示[14]：

(1)

式中:θ為休止角，°；h為物料堆高度，mm；r為圓盤半徑，mm。

1.3.7 微膠囊水分的測定

精密稱取固體粉末微膠囊1 g左右于干燥至恒重的鋁盒中，置于105 ℃干燥箱中干燥2 h后，蓋好鋁蓋取出，隨后放入干燥器中冷卻0.5 h后稱重，重復以上操作，直到前后質量差不超過2 mg，通過計算得出微膠囊產(chǎn)品水分質量分數(shù)，其計算如公式(2)所示[15]：

(2)

式中：m1，鋁盒和樣品的質量，g；m2，鋁盒的質量，g；m3，鋁盒和樣品干燥后的質量，g。

1.3.8 有效載量的測定

產(chǎn)品中甜橙油總含量的測定：稱取0.5 g凍干后微膠囊粉末，加入10 mL無水乙醇磁力攪拌20 min，30 ℃、100 W條件下超聲10 min，在4 000 r/min下離心5 min，洗去無水乙醇相，再向剩下的沉淀中加入10 mL無水乙醇，重復上述操作至少3次，0.22 μm有機濾膜過濾后在317 nm處測其吸光度。

表面油含量的測定：同樣精密稱取0.5 g凍干后的微膠囊粉末，加入10 mL無水乙醇，輕微振蕩1 min，洗脫包合物表面的甜橙油，然后3 000 r/min離心1 min，傾出乙醇相，再向沉淀中加入10 mL乙醇，重復上述操作3次，合并乙醇相，經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后，在317 nm處測定吸光度。有效載量的計算如公式(3)所示：

(3)

1.3.9 乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測定

將SPI、HSPI、經(jīng)干燥制得的SPI-SA復聚物和HSPI-SA復聚物，分別溶于pH=7的混合磷酸鹽緩沖液中，配制成1 g/L的樣品溶液。取75 mL樣品溶液于250 mL燒杯中，加入25 mL大豆色拉油，在10 000 r/min條件下均質1 min后，迅速從底部吸取乳化液50 μL，稀釋于5 mL、0.1%(質量分數(shù))SDS溶液中，用0.1%的SDS溶液作為對照，立即使用分光光度計測定其在500 nm吸光值(A)。EAI和ESI計算如公式(4)、公式(5)所示[16]：

(4)

式中：EAI，m2/g；A0，測定的吸光度值；φ，大豆油占乳液的體積比；ρ，HSPI乳化之前的質量濃度，g/mL。

(5)

式中：ESI，min；A0，均質后迅速吸取的乳化液的吸光值；At，乳化液靜止后的吸光值；t，時間差。

1.3.10 微膠囊熱重分析

分別稱取約5 mg的甜橙油及冷凍干燥的甜橙油微膠囊粉末樣品，采用熱重分析儀測量其熱釋放曲線，測量條件如下：初始溫度25 ℃，以20 ℃/min的速率升溫至400 ℃，載氣為氮氣，流量為30 mL/min。

1.3.11 甜橙油微膠囊揮發(fā)性成分分析

樣品準備：稱取約0.3 g甜橙油微膠囊溶液，置于15 mL固相微萃取樣品瓶中，密封，80 ℃下水浴加熱，處理時間分別為0、1、3、5、7 h。

SPME條件：將處理后的樣品置于40 ℃的水浴中[17]，用75 μm CAR/PMDS萃取頭吸附30 min。將萃取頭取下置于GC進樣口解吸10 min，進樣口溫度為250 ℃。

GC條件：采用DB-WAX毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為氦氣，流速為1.8 mL/min。升溫程序：40 ℃維持1 min，后以5 ℃/min升溫至60 ℃，隨后以10 ℃/min升溫至100 ℃并保持3 min，最后以5 ℃/min升溫至180 ℃并保持2 min。

MS條件：電離方式為EV，電子能量70 eV，燈絲發(fā)射電流為35 μA，掃描速率4.45 次/s，質量掃描范圍 35～450m/z。

以正構烷烴C6～C20的實際測量值校正保留時間。通過NIST17Library譜庫對測試結果進行檢索，取匹配度80%以上的揮發(fā)性成分。采用辛酸乙酯(1 mg/mL，溶劑為甲醇)作為內標進行定量分析。

1.3.12 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2018對柱狀圖和折線圖進行繪制，每個樣品均重復3次，描述性統(tǒng)計值以x±s表示。

2 結果與分析

2.1 微膠囊壁材的ζ-電位

HSPI是由SPI水解而成的酶解大豆蛋白，其本身帶有羧基與氨基，其帶電的性質直接決定于環(huán)境中所帶的pH值。由圖1可知，HSPI等電點(isoelectric point，pI)在4.2左右，在pH<4.2時HSPI帶正電，在pH>4.2時HSPI帶負電。SA由葡萄糖醛酸(G)和甘露醇酸(M)組成，形成M塊和G塊以及交替序列塊的區(qū)域[18]在pH 2.5～6.0均帶負電，并且所帶負電基團數(shù)隨pH的減小而減少。由此可知，當HSPI的pI<4.2時，由于正負電荷的吸引作用，使HSPI具備與SA發(fā)生靜電相互作用的能力。

圖1 不同pH下HSPI和SA的ζ-電位值Fig.1 ζ-potential values of HSPI and SA at different pHs

2.2 不同HSPI與SA質量比下復聚物的形成

2種膠體由于發(fā)生靜電相互作用生成乳白色渾濁液，從而降低該溶液的光透過性，且反應程度與透光性成正比關系。濁度滴定曲線開始于pH 6.0，此pH下由于HSPI與SA兩分子之間的靜電相互作用斥力而使溶液均一透明。由圖2可知，隨著pH的下降，有一部分帶正電基團的蛋白分子與帶負電的SA發(fā)生微弱的靜電相互作用，溶液由于混合光密度值的升高(OD600)，出現(xiàn)輕微的渾濁，溶液整體泛著淡淡的乳光，此過程被定義為可溶性復聚物的生成階段[19]，對應的pH臨界值為pHc。隨著pH的進一步降低，由于靜電相互作用反應的增強，體系OD600值迅速攀升，如在m(HSP)∶m(SA)=7∶1體系中，pH值由4.5降至3.5時，OD600由0.151快速上升至0.802，說明在pH 4.5左右不可溶性復聚物開始生成，對應臨界值pHφ1，此時由于蛋白多糖結合成緊密結構致使溶液呈現(xiàn)非透明狀的乳白色，這被解釋為奧斯特熟化現(xiàn)象[20]；當該體系pH達到3.5時，OD600達到峰值為0.802，對應pHopt；pH繼續(xù)減小，在pH 3.0左右出現(xiàn)拐點值，此時對應臨界值為pHa，經(jīng)過此拐點，OD600值呈現(xiàn)更為緩慢的下降趨勢，靜電相互作用力逐漸減弱，直到OD600開始不再發(fā)生變化，此時所對應的是反應的pHφ2處。由于本文主要研究不可溶性復聚物，因此pHc到pHa所對應的OD600為主要研究區(qū)域。

由圖2可知，HSPI-SA不同比例下出現(xiàn)的OD600峰值是不同的，這是由于HSPI和SA分子結構、電荷數(shù)量不同而導致不可溶性復合物內部致密性不同，而復合凝聚微膠囊形成的原理是當不可溶性復合物出現(xiàn)pI值時，復聚物內部致密度能夠達到最高，此時所對應的OD600值也最大。當m(HSP)∶m(SA)=7∶1，pH 3.5時，OD600也達到峰值。

圖2 HSPI-SA復合溶液的濁度滴定曲線Fig.2 Effect of biopolymers mixing ratio and pH on the turbidity for the system of HSPI-SA

2.3 溫度對HSPI-SA復聚物形成的影響

由圖3可知，隨著溫度的升高，OD600峰值逐漸減小并且其對應的pHopt逐漸減小，說明溫度的升高在一定程度上阻礙了復合凝聚物的生成，這可能是由于部分氫鍵斷裂所導致。一般情況下，溫度較高時，分子的運動速度增加，疏水相互作用增強，氫鍵減弱[4]。GIRARD等[21]研究也發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，β-乳球蛋白-高甲氧基果膠形成復合凝聚物的產(chǎn)量逐漸減少。當pH低于pHopt時，OD600值迅速下降，到達pHa時出現(xiàn)拐點，在 25、35、45 ℃ 時，其拐點分別出現(xiàn)在pH 3.1、pH 2.8和pH 2.6處。當pH

圖3 HSPI-SA復合溶液濁度曲線Fig.3 Turbidity curves of HSPI-SA mixtures as a function of temperature

2.4 甜橙油微膠囊產(chǎn)品的理化指標

對于粉末狀微膠囊而言，過高的水分含量在后續(xù)的貯藏過程中容易使樣品結塊和霉變[22]。由表1可知，2種微膠囊的水分含量都較低，而HSC微膠囊水分含量略低于ISC微膠囊，說明HSC微膠囊更易于保藏。微膠囊產(chǎn)品的流動性一般用休止角評價，休止角在30°～45°則說明粉末流動性較好，當休止角>45° 時則表明粉末流動性一般[23]。HSC微膠囊休止角為38.7°優(yōu)于SPI-SA微膠囊46.5°，說明HSC微膠囊流動性相對較好。這可能是由于經(jīng)過酶解反應制成的微膠囊較小增加了其流動性能。微膠囊產(chǎn)品的有效載量越高其產(chǎn)品質量越高，由此得出HSC有效載量略高于ISC微膠囊。

表1 甜橙油微膠囊產(chǎn)品的理化指標Table 1 Physical and chemical properties of sweet orange oil microcapsules

2.5 乳化活性和乳化穩(wěn)定性

由圖4可知，復合凝聚反應使EAI顯著增高，而ESI也比單獨的蛋白高，這可能是因為復合凝聚反應與糖結合促進蛋白暴露出更多的反應位點，減小了油滴與蛋白疏水部位結合的位阻。而較高的ESI值能使包埋的疏水性物質保持較長時間的穩(wěn)定，說明復合凝聚反應比單個蛋白更適合疏水性物質的包埋。而較高的EAI反映出其與油滴之間的親和能力較強[22]，這也是復合凝聚物對芯材具有更高載量的重要原因。由于微膠囊乳化停留時間一般不超過10 min，而復合凝聚物中，ESI最小值為42.1 min，遠遠大于10 min，說明2種復聚物的ESI值均能達到微膠囊性質要求。由此可見，HSPI-SA復聚物較SPI-SA復聚物對于疏水性芯材物質更具有親和力，更適合作為復合凝聚壁材。

圖4 SPI、HSPI、SPI-SA復聚物和HSPI-SA復聚物乳化性質的影響Fig.4 The thee mulsifying properties of SPI、HSPI、SPI-SA coacervation and HSPI-SA coacervation

2.6 熱重分析

熱重分析(thermo-gravimetric analysis, TGA)是指在程序控制升溫條件下，待測樣品由于溫度升高發(fā)生物理化學變化而導致本身質量的變化，因此微膠囊的熱重曲線是衡量其耐熱性好壞的重要分析指標，常應用于測定熱分解溫度以及分析熱穩(wěn)定性和熱分解動力學等[25]。圖5為單獨的芯材甜橙油、HSC和ISC在0～400 ℃的熱重分析曲線。其中，未經(jīng)包埋的甜橙油質量損失速率呈先平緩后增大的趨勢，尤其是在達到75 ℃以上時，質量迅速損失，當溫度上升至150 ℃時，損失程度幾乎達到100%。而HSC和ISC中，熱重變化可分為3個部分，其中低于200 ℃為第一階段，此階段2種微膠囊的質量損失都較小，這種現(xiàn)象可能與殘留水分的質量損失有關，較低溫度可能會導致水分與物質分離。200～350 ℃升溫過程為第二階段，2種微膠囊均出現(xiàn)最大的質量損失，HSPI-SA微膠囊質量損失達到37.2%，ISC微膠囊達到44.7%，表明此階段部分芯材出現(xiàn)泄漏現(xiàn)象，并且ISC微膠囊損失程度大于HSC微膠囊損失程度。第3階段為350～400 ℃，仍能觀測到微膠囊的部分熱降解，而曲線呈現(xiàn)平緩下降趨勢，意味著此時的2種微膠囊仍然具有一定的耐熱性，至400 ℃時，HSC質量比仍高于ISC，由此說明，由HSPI制備的微膠囊耐熱性比SPI制備的微膠囊更好。

圖5 甜橙油及復合凝聚微膠囊熱重分析Fig.5 The TGA curves of sweet orange oil and microcapsules

2.7 熱處理時間對甜橙油微膠囊揮發(fā)性風味成分的影響

表2為HSC預先經(jīng)80 ℃下加熱不同時間后，通過SPME- GC-MS檢測得到的揮發(fā)性風味物質的組成及含量。由于微膠囊溶液是液固體共存狀態(tài)，采用SPME萃取技術能充分富集體系中的揮發(fā)性成分[24]。對于香精微膠囊，耐熱性是衡量微膠囊保香性質的重要分析指標，通過該指標可探究HSC在高溫條件下可耐受的最佳保香時間。

從表2可以看出，不同加熱時間下甜橙油微膠囊中共檢測到48種揮發(fā)性風味化合物，隨著加熱時間的增加，甜橙油大部分揮發(fā)性風味物質含量均不同程度地減小，但同時，有些物質隨著加熱時間的增加呈相反趨勢，如α-松油醇、香芹酮和香芹醇。α-松油醇被認為是在甜橙油貯藏過程中變質時產(chǎn)生的最重要的一類揮發(fā)性化合物之一，因其賦予食物陳腐和霉臭特征味道[25]，因此把它作為甜橙油變質的重要指標[26]，而α-松油醇在微膠囊加熱前5 h含量未檢出，到第7 h時其含量高達6.463 μg/g，說明加熱到7 h時甜橙油已變質。同時由于加熱時間的延長，D-檸檬烯極易氧化生成香芹酮和香芹醇，這也是導致甜橙油變質的主要原因[27]。

由表2和圖6可知，D-檸檬烯(D-limonene)、癸醛(decanal)、月桂烯(myrcene)、辛醛(octanal)、芳樟醇(linalool)、α-蒎烯(α-pinene)和檸檬醛(citral)含量較高，通常被認為是甜橙油的特征風味物質[27-28]。其中，含量最高的為D-檸檬烯(含量82.63%)，具有檸檬與橘子的混合香味[29]，而芳樟醇的風味閾值很低，具有濃郁的花香[30], 癸醛具有滲透性的桔香和果甜香，月桂烯兼具藥草味和柑桔味混合香氣，而檸檬醛和辛醛則是具有強烈的似檸檬的香味和桔子的甜味[29]，它們共同構成了甜橙油特征香型的主體輪廓。如圖6所示，隨著加熱時間的延長，7種主要特征風味物質含量均有所減小。在加熱至1 h時，微膠囊可有效保護內部芯材物質，延至第5 h時，大部分特征風味物質仍能保持在50%左右，到第7 h時，4種含量最高的特征性風味物質(D-檸檬烯，葵醛，月桂烯和辛醛)均降至30%以下，說明此時甜橙油風味識別極差，同時也表明HSC無法耐受5 h以上的高溫。

表2 甜橙油微膠囊于80 ℃ 下加熱不同時間后的揮發(fā)性物質的組成及含量 單位：μg/g

I-D-檸檬烯；D-癸醛；M-月桂烯；O-辛醛；L-芳樟醇；P-α-蒎烯；C-檸檬醛圖6 不同加熱時間處理下HSC的主要揮發(fā)性成分比較Fig.6 The comparation of major volatile compounds of HSC heated at 80 ℃ for various hours

3 結論

以水解度為2%的HSPI與SA為復合凝聚壁材，通過ζ-電位確定HSPI的pI值為4.2，即HSPI與SA發(fā)生的最大靜電相互作用在4.2以下。以濁度滴定曲線為主要參考指標，發(fā)現(xiàn)靜電相互作用3個臨界點pHc、pHφ1和pHopt隨HSPI與SA質量比增加而增加，而隨體系反應溫度的增高均減小，并通過pHopt確定HSPI-SA復聚物最適壁材質量比為7∶1，最適溫度為25 ℃。以甜橙油微膠囊的理化指標、ESI、EAI和熱重分析為主要考察指標，結果發(fā)現(xiàn)，HSC耐貯藏性、耐熱性和對芯材的親和力均優(yōu)于ISC。利用SPME-GC-MS測定不同加熱時間下甜橙油微膠囊揮發(fā)性風味物質的種類與含量，發(fā)現(xiàn)HSC無法耐受5 h以上的高溫，本研究為風味微膠囊在食品熱加工中應用提供理論基礎。